基于Gateway技术建立的慢病毒载体转染食蟹猴胚胎干细胞的实验研究

摘要

胚胎干细胞是来源于早期胚胎内细胞团(inner cell mass，ICM)或桑椹胚的一种多潜能细胞[1]，能在体外自我更新，并且可以在适合的条件下分化为胚胎或成体的各种类型的组织细胞[2]，也可以和宿主囊胚进行嵌合，因而成为当前生物工程研究的热点，在细胞生物学、发育生物学、遗传学、神经生物学和1临床医学等领域中发挥着日益重要的作用[3，4]。由于在伦理、道德等多方面存在争议，人类胚胎干细胞的相关研究受到诸多限制[5，6]。而非人灵长类由于在进化地位上与人类的近亲关系而成为基础研究与临床医用的不可替代的桥梁。非人灵长类胚胎干细胞与人胚胎干细胞具有非常相似的生物学特性。食蟹猴为灵长目猴科，可作为人类发育的体外模型。此外，食蟹猴胚胎干细胞可为人类胚胎干细胞的研究及应用人胚胎干细胞治疗一系列疾病提供经验。 将外源基因通过一定载体转入靶细胞内的技术称为转基因技术。目前，转基因技术在干细胞的研究中起着越来越重要的作用。通过转基因技术使干细胞携带有标记基因，可以在体内实验中作为示踪剂，对移植的细胞进行跟踪；体外实验中，标记基因便于干细胞的观察，特别是与其他细胞共培养的体系中，可以清楚的观察干细胞的变化。 鉴于上述食蟹猴胚胎干细胞和转基因技术的重要作用，因此如何能将外源基因高效地转入食蟹猴胚胎干细胞并能在不影响其生物学特性的情况下持续稳定表达就显得十分必要。目前，转基因的方法有很多种[7]，但灵长类胚胎干细胞由于呈克隆状生长，生长环境比较复杂，培养条件比较苛刻，很难转染外源基因而得到较纯的克隆，较理想的转染方法多是通过慢病毒载体介导而完成的。慢病毒载体中含有目的基因的载体质粒需要根据实验要求自行构建，传统的质粒构建技术需要酶切、连接等过程，操作过程繁琐复杂，并且有假阳性的出现，明显阻碍了实验的快速进行。因此，近年来兴起了一种更为灵活通用的克隆方法-Gateway技术，Gateway技术是利用九噬菌体特异性结合位点可在Clonase的作用下整合到宿主E．coli的基因组中的一种新的通用型克隆技术。利用Gateway技术构建载体，只需要在目的基因两端加上特异性的15bp大小的att结合位点，通过两种Clonase作用下的BP和LR结合反应，即可将目的基因导入载体中，其整合率可达到100％。而且去除了酶切、连接过程，可以避免假阳性的出现。因其操作方便,Gateway技术近年来在基因工程中的应用已越来越广泛。有鉴于此，本实验的主要研究思路是利用Gateway技术构建2K7puto/EF1-α-dTomato和2K7puto/EF1—α-hrGFP两种载体质粒，通过病毒包装产生慢病毒，然后利用获得的慢病毒转染食蟹猴胚胎干细胞，通过对转染后的细胞进行纯化，得到完全表达dTomato和hrGFP的阳性克隆，并简单研究这两种转染后的食蟹猴胚胎干细胞的生物学特性。因此，本研究分为以下两个部分内容： 第一部分：利用Gateway技术构建2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP两种慢病毒载体。 第二部分：2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP慢病毒载体转染食蟹猴胚胎干细胞的实验研究。 第一部分利用Gateway技术构建2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP慢病毒载体 1.1 目的: 利用Gateway技术构建2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP两种载体质粒，通过病毒包装技术产生相应慢病毒，高速离心后对病毒进行浓缩，测定病毒滴度，并评价病毒的生物安全性，目的在于通过操作简便的Gateway技术和病毒包装技术构建安全、高效的慢病毒载体。 1.2 方法： 1.2.1利用Gateway技术中涉及到的LR结合反应，将入门克隆PDONRTM221-dTomato/PDONRTM221-hrGFP和PDONRTML4-EF1-α-R1与目的载体2K7puro进行连接，构建2K7puro/EF1-α—dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP载体质粒。 1.2.2分别将2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP载体质粒与ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix共转染293FT细胞，收集及浓缩病毒。 1.2.3采用梯度稀释法对病毒滴度进行测定。 1.2.4用病毒原液感染293FT细胞，收集含病毒的条件培养液，再次感染新的293FT细胞，观察新感染的293FT细胞有无荧光表达，评价病毒的生物安全性。 1.3 结果： 1.3.1 入门克隆PDONRTM221-dTomato/PDONRTM221-hrGFP 和PDONRTML4-EF1-α-R1与目的载体2K7puro进行LR结合反应后，得到2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP载体质粒，质粒转化入大肠杆菌后，得到单细菌克隆。 1.3.2将2K7puro/EF1-α—dTomato和2K7puro/EF1-α—hrGFP载体质粒与ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix共转染239FT细胞48h至72h后，荧光显微镜下可观察到强红色荧光和绿色荧光并有细胞融合现象，收集病毒上清液高速离心后，可见病毒颗粒沉淀在离心管底部。 1.3.3梯度稀释法测定本实验包装产生的两种慢病毒2K7puro/EF1-α-dTomatoTto和2K7puro/EF1-α-hrGFP滴度分别为：5.4×107TU/ml和17.6×107TU/ml。 1.3.4收集感染过上述病毒的293FT细胞的条件培养液，再次感染新的293FT细胞后，未见新感染的293FT细胞有荧光表达，证明上述病毒具有自身灭活作用。 1.4 结论： 1.4.1成功构建2K7puro/EF1-α-dTomato和D2K7puro/EF1-α-hrGFP载体质粒。 1.4.2利用2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP载体质粒成功包装产生两种慢病毒。 1.4.3两种慢病毒滴度分别为：5.4×107TU/ml和7.6×107TU/ml。 1.4.4病毒生物安全性评价结果表明病毒感染细胞后无复制能力，培养液中无病毒颗粒释放。 第二部分2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP慢病毒载体转染食蟹猴胚胎干细胞的实验研究 2.1目的： 将2K7pruo/EF1-α-dTomato和2K7puro/EE1-α-hrGFP慢病毒载体分别转染cmES，使其分别表达dTomato和qhrGFP，纯化转染后的cmES，通过免疫荧光染色鉴定纯化后的cmES，并通过体外分化实验证明纯化后的cmES具有多向分化潜能。目的在于通过慢病毒转染这种高效率的转基因方法，得到保持cmES生物学特性的分别表达dTomato和hrGFP的纯阳性cmES克隆(dTomato-cmES和hrGFP-cmES)。 2.2方法： 2.2.1分别利用2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP两种慢病毒载体转染dTomato和hrGFP进)kcmES，荧光倒置显微镜下观察转染情况。 2.2.2利用胰酶消化和连续机械法传代两种方法纯化转染后的cmES。 2.2.3 dTomato-cmES和hrGFP—cmES生物学特性的分析：对dTomato-cmES和hrGFP-cmES的分子标记及体外分化能力进行检测。 2.3结果： 2.3.1慢病毒转染48h后，荧光倒置显微镜下可见部分cmES克隆表达红色荧光或绿色荧光，克隆均为部分表达荧光，未见纯的阳性克隆。转染后的cmES克隆状态与转染前无明显区别，克隆生长情况良好，仅见极少量的死细胞。 2.3.2胰酶消化转染后的cmES克隆成单细胞或连续5次以上机械法传代后，可得到完全表达dTomato和hrGFP的阳性cmES克隆。 2.3.3 dTomato—cmES和hrGFP—cmES生物学特性：dTomato-cmES和hrGFP-cmES表达OCT-4、SSEA-4和TRA-1-60，而不表达SSEA-1和SSEA-3。dTomato—cmES和hrGFP-cmES自然分化形成的胚体中含有三胚层的细胞。 2.4结论： 2.4.1成功利用慢病毒转染cmES，转染后的cmES部分表达dTomato或hrGFP，细胞生长基本不受病毒转染的影响。 2.4.2成功获得完全表达dTomato和hrGFP的阳性cmES克隆。 2.4.3 dTomato-cmES和hrFP-cmES具有普通cmES的生物学特性，可以为下一步的体内外研究提供有效的示踪工具

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引言

第一部分利用Gateway技术构建2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP慢病毒载体

材料

方法

结果

小结

讨论

第二部分2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP慢病毒载体转染食蟹猴胚胎干细胞的实验研究

材料

方法

结果

小结

讨论

全文总结

参考文献

附图一

附图二

致谢