大鼠视网膜胶质细胞原代培养及永生化研究

摘要

Müller细胞是视网膜中主要的神经胶质细胞。以往人们认为，Müller细胞通过发出分支包围、分隔神经元的胞体和突起而对神经元起支持和营养作用。近来研究表明Müller细胞还具有维持细胞外微环境平衡和调节神经元细胞活动等作用。在外伤性增殖性玻璃体视网膜病变等眼病中，Müller细胞通过表达一些生长因子与该疾病的发生与发展密切相关。该细胞在视网膜中的作用正日益受到人们的重视。但由于原代培养的视网膜胶质细胞传代次数有限，制约了进一步的研究。 细胞永生化最常用的方法是基因转染，SV40 Tag基因是较为常用的体外永生化目的基因片段之一。猴病毒40(simianvirus40，sv40)为双股环状。DNA病毒，是1960年在用猴肾细胞培养制备脊髓灰质炎病毒疫苗过程中发现的，它由结构蛋白(VP1、VP2、VP3)和SV40早期转录区基因编码的大T和小t抗原组成。大T抗原为细胞转化启动所必需，而且转化细胞表型的维持必须有大T抗原的连续表达。 本研究以酶消化法原代培养大鼠视网膜胶质细胞，采用逆转录病毒载体的方法将大T抗原转染入其中，拟建立永生化视网膜胶质细胞系，并对转染后的细胞在动物眼玻璃体腔内生长进行了观察。大鼠视网膜胶质细胞系的建立将为进一步研究增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)、糖尿病玻璃体视网膜病变(PDR)等提供理想的细胞来源。 一研究目的： 利用酶消化法原代培养的大鼠视网膜胶质细胞，以SV40大T抗原(SV40LT)转染之，拟建立永生化大鼠视网膜胶质细胞系，并对其生物学性状进行研究。 二实验方法： 1、酶消化法体外原代培养大鼠视网膜胶质细胞，相差显微镜观察细胞形态，MTT比色法绘制细胞生长曲线，免疫组织化学对细胞进行鉴定。 2、通过Lipofeetomin2000转染携带SV40LT抗原的质粒进入第三代原代培养的大鼠视网膜胶质细胞，潮霉素筛选并传代；相差显微镜和MTT比色法观察转染后细胞生长及增殖情况；免疫组织化学和RT-PCR检测永生化大鼠视网膜胶质细胞SV40大T抗原、GFAP、VIM表达。 3、将转染SV40LT抗原后的胶质细胞注射入大鼠玻璃体腔，HE染色观察其在眼内生长情况，免疫组织化学鉴定细胞成分。 三．实验结果： 1、利用酶消化法成功原代培养出大鼠视网膜胶质细胞。视网膜胶质细胞培养贴壁生长，细胞呈星形、不规则形，消化后的细胞呈圆或椭圆形。传至第三代时，经免疫组化鉴定，Müller细胞已占98％以上。传代至第10代，出现细胞生长缓慢甚至停滞，传代后不生长。 2、转染SV40大T抗原后的视网膜胶质细胞生长旺盛，可反复传代，目前已达30代。倒置显微镜下，细胞为单层贴壁生长，形态呈多角形、哑铃形等典型的胶质细胞样特征。免疫组化染色GFAP，VIM，SV40LT呈阳性表达。RT—PCR扩增检测GFAP，VIM，SV40LT出现阳性条带。 3、转染后的视网膜胶质细胞注入大鼠玻璃体腔，能生长存活，位于晶状体后视网膜前，呈膜样。免疫组化鉴定显示构成该膜的细胞以GFAP、VIM阳性细胞为主。 四结论： 1、运用胰酶消化培养法可成功培养原代大鼠视网膜胶质细胞，并能传代培养，但次数有限且细胞生长较慢。 2、利用SV40LT抗原转染大鼠视网膜胶质细胞后，该细胞获得转化，生长旺盛，寿命延长，目前已传至30代，且具有正常大鼠视网膜胶质细胞的表型，有望建立细胞系。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩写

声明

前言

材料和方法

结果

讨论

总结

参考文献

致谢