血小板TLR4介导LPS诱导的血小板活化

摘要

Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是新近发现的一类天然免疫受体，可对病原体相关分子模式进行识别、结合，并引发一系列信号转导，进而导致炎性介质的释放，在天然免疫防御中起着重要作用，并最终激活获得性免疫系统。TLR家族成员至少有13个(TLR1～TLR13)，它们可针对不同的病原体成分诱导精细的抗感染天然免疫。其中TLR4除了介导对脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)的应答外，还与许多临床疾病如大面积烧伤后引发的全身性炎性反应综合征、动脉粥样硬化、牙周炎等有关。 LPS是革兰氏阴性细菌的主要表面成分，是机体免疫系统对入侵的革兰氏阴性菌的首要识别及攻击目标，同时也在致病菌侵染宿主细胞过程中起重要作用。LPS首先与血清的LPS结合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein，LBP)结合，然后再与细胞表面的CD14分子结合，CD14又通过糖基磷脂酞肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol，GPI)锚定于细胞膜。髓样分化蛋白2(myeloid differential protein-2，MD2)是一种分泌性蛋白，能与TLR4的胞外区结合，从而提高其对LPS的敏感性并增强受体结构的稳定性。TLR4与LPS结合后引发一系列的胞内信号转导，导致炎性介质释放，这不仅在天然免疫防御中发挥重要的作用，且最终激活获得性免疫系统。故TLR4在由天然免疫向获得性免疫的转变中发挥了重要的作用。 血小板膜和胞浆均表达TLR4，且其胞浆水平在血小板活化后显著升高。2005年，Andonegui等第一次证实了血小板确实表达有功能性的TLR4，同时他们的研究发现巨核细胞表达TLR4，并且TLR4的表达随着巨核细胞的成熟(CD41表达增加)而增加，表明血小板TLR4来源于巨核细胞表达的延续，从而为血小板功能研究提供了新的思路。 CD62p是目前所知最能反映血小板活化的特异性标志物，亦称GMP140、P选择素或PADGM蛋白(血小板活化依赖性颗粒性膜蛋白)，定位于静止血小板α颗粒和活化血小板的质膜上。有研究发现，脓毒症患者外周血中血小板CD62p表达增加，而且脓毒症的严重程度与CD62p表达呈正相关。另外在LPS诱发败血症的动物模型中发现，血小板数量及聚集性显著下降，表明LPS参与了细菌介导的血小板破坏。 纤溶酶原激活剂抑制剂(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)是纤溶系统的重要负调控因子。病理条件下，革兰氏阴性细菌产生的内毒素能影响多种凝血、纤溶系统的蛋白，诱发血栓形成和脏器功能衰竭。动物实验中给大鼠注射LPS，可导致机体内皮细胞和血管平滑肌细胞等合成释放PAI-1增加，血浆PAI-1水平升高，加速凝血过程和减缓纤溶过程。富含血小板的动脉血栓对溶栓剂耐受的重要原因之一就是活化血小板释放PAI-1，升高了血栓局部的PAI-1水平，抑制了纤溶酶活化剂如组织型凝血酶原激活剂(tissue-plasminogen activator，t-PA)、尿激酶型凝血酶原激活剂(trokinase-plasminogen activator，u-PA)等的作用。 目前对血小板表达的TLR4是否具有生物学功能争论不一。本实验在体外通过检测LPS作用前后血小板TLR4的表达以及与血小板CD62p、PAI-1表达和血小板聚集的关系，探讨TLR4在血小板功能变化中的作用，为进一步阐明血小板TLR4的生物学功能提供依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章前言

第2章材料与方法

2.1标本来源

2.2观察内容

2.3试剂和仪器

2.4实验原理及方法

2.5统计分析

第3章结果

3.1 LPS作用前后PAG(M)（表3-1）（图9）

3.2 FCM检测LPS作用前后血小板CD62p和TLR4的表达

3.3 Western blot检测LPS作用前后血小板TLR4和PAI-1的表达

3.4血小板TLR4表达与CD62p、PAI-1表达及PAG(M)的关系（附录3表3）（图14～16）

3.5 LPS浓度变化对血小板CD62p、TLR4和PAI-1表达及对PAG(M)的影响（附录3表2）

第4章讨论

4.1人血小板表达TLR4

4.2 LPS对血小板TLR4表达的影响

4.3 LPS对血小板CD62p的影响及其与TLR4的关系

4.4 LPS对血小板PAI-1的影响及其与TLR4的关系

4.5 LPS对血小板最大聚集率的影响

第5章结论

参考文献

附录

致谢