三七人参皂甙Rd对高血压过程中大鼠脑基底动脉Ca运动、NO水平变化的影响

摘要

高血压是最常见的全身性的慢性的疾病，它是导致脑中风、心肌梗塞和终末期肾功能衰竭的主要危险因素。小动脉病变是高血压病最重要的病理改变，高血压早期阶段全身小动脉痉挛，长期反复的痉挛使小动脉内膜因压力负荷增加、缺血缺氧出现玻璃样变，中层则因平滑肌细胞增殖、肥大而增厚，出现血管壁的重构(remoldling)，最后管壁纤维化、管腔狭窄呈现出不可逆病变，最终导致组织器官的缺血损伤。其中动脉痉挛最主要的原因就是胞内Ca2+转运出现了异常。Ca2+是细胞内普遍存在重要的信号转导成分，不同生物信号刺激引起胞浆游离Ca2+水平的变化，由此触发细胞代谢、分泌、增殖、分化、收缩等生物效应。Ca2+的升高依赖于细胞膜上Ca2+通道介导的胞外Ca2+内流和胞内Ca2+池的Ca2+释放，这是胞内Ca2+浓度持续升高的重要方式。 一氧化氮(NO)是L—精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)催化下生成的，它弥散入细胞，激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，产生环磷酸鸟苷(cGMP)而发挥作用。NOS包括三种同工酶：内皮型NOS(eNOS)、神经型NOS(nNOS)和诱生型NOS(iNOS)。nNOS和eNOS合称结构型NOS(cNOS)，是Ca2+和钙调素(calmodulin，CaM)依赖性的酶，受细胞内Ca2+浓度的生理调节，在脑内，主要是存在于内皮细胞和周围的神经组织中，基础的条件下或者是在各种生理性刺激下产生NO，但是与心血管疾病有关的NOS主要为eNOS和iNOS。血管内皮细胞内含有丰富的eNOS，由它们催化生成的NO量较少，但具有广泛的生理功能。在心血管系统中，NO具有调节血压、扩张血管、抑制血小板聚集和白细胞黏附、抑制血管平滑肌细胞增殖的作用，因此在防止心血管疾病的发生发展方面发挥重要的保护作用。iNOS是从巨噬细胞和肝细胞中发现的，存在于心肌细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞及炎症细胞中，一些心血管病变也可能诱导iNOS生成。 CaMKⅡ由四种不同基因编码α，β，γ，δ，其中CaMKⅡγ和δ在心血管系统高表达。CaMKⅡ全酶由6-12个亚基组成，并行成车轮样结构，基础状态时CaMKⅡ的活性比较低，主要是由于该酶存自身抑制域，并且其靠近活性区域，从而可以阻断酶与底物结合，位于该区域的几个氨基酸残基已经被证实具有这种竞争性的阻断能力。Ca2+/CaM结合到CaMKⅡ的自身抑制域并且包裹该区域，从而使位于CaMKⅡ催化域上的活性位点得以靠近底物而发挥作用，即导致CaMKⅡ的激活。CaMKⅡ是一个具有多种功能的蛋白激酶，参与了很多的生理过程如：Ca2+火花、细胞周期、凋亡、基因表达、神经传递、长时程增强、记忆、突触的可塑性、动脉的收缩和去极化等。很多资料证明CaMKⅡ通过调节Ca2+通道和基因的表达，从而调节心血管病理性的重构，CaMKⅡ在心血管中被激活后可以诱导平滑肌细胞肥厚和增殖。 本实验是研究三七人参皂甙Rd对高血压过程中大鼠脑基底动脉上Ca2+运动和NO水平变化的影响，以及它可能的作用机制。ROCC和SOCC广泛表达在兴奋细胞和非兴奋细胞中，参与了很多生理功能和病理过程如：细胞增殖和凋亡、缺氧和缺血诱导的脑神经损伤、外伤性脑损伤以及炎症反应等。因此研制一个特异的、有效的ROCC和SOCC阻断剂对于研究治疗这些疾病的新药物是很重要的。很多研究报道1，4-二氢吡啶类派生物经过结构改动以后可能可以阻断SOCC，合成型的雌激素激动剂已酰雌酚也可以阻断SOCC和容量性的Ca2+内流，三七人参皂甙Rd从结构上和1，4双氢吡啶类的不同，它是从三七总皂甙中提取一种单体成分，分子量为1001.2，分子式为C48H82O18·3H2O，实验证明三七总皂甙可以阻断α1-肾上腺受体激活的血管平滑肌收缩反应和45Ca的内流，而对Ca2+释放和高KC1诱导的血管平滑肌收缩反应没有影响，说明三七总皂甙可能是ROCC的阻断剂，三七人参皂甙Rd是从三七总皂甙中提取单体成份，在对其研究中发现，它可以阻断α1-肾上腺受体和5-HT受体激活的Ca2+内流，以及Phe和TG诱导的Ca2+内流，而对无Ca2+中Phe和TG诱导的Ca2+内流没有作用，从而说明三七人参皂甙Rd只对ROCC、SOCC有作用而对Ca2+释放没有作用，同时三七人参皂甙Rd对KC1和BayK8644诱导VDCC的Ca2+内流没有作用，从而进一步证明其是ROCC、SOCC特异性的阻断剂。ATP是受体操纵性和Ca2+池操纵性Ca2+通道的激动剂，它主要是和细胞膜上的受体结合，导致ROCC的开放，同时也可以激活PLC，产生大量IP3，作用于肌浆网上的IP3受体，导致肌浆网内的Ca2+释放，Ca2+池耗竭，从而再通过各种机制激活细胞膜上的SOCC，是用于研究ROCC和SOCC的激动剂。OAG是特异性ROCC的激动剂，该激动剂的主要作用是和细胞膜上特异性的受体结合，直接激活ROCC，从而导致胞内Ca2+的内流，而对SOCC没有作用，是用于研究ROCC的工具药。TG是肌浆网上的钙泵抑制剂，它抑制肌浆网上的Ca2+—ATPase，抑制肌浆网对细胞内Ca2+的再摄取，从而导致肌浆网内的Ca2+耗竭，激活SOCC，是用于研究SOCC的工具药。Mn2+和Ca2+都是二价的阳离子，都可以通过Ca2+通道进入细胞内，但是Mn2+和Ca2+不同的是：Ca2+和Fura—2结合，激发一种蓝色的荧光，在无Ca2+液中，Mn2+进入细胞可以替代Ca2+和Fura—2结合，导致荧光的淬灭，Ca2+通道开放越多，进入的Mn2+越多，荧光淬灭越明显。比较它们的最大荧光淬灭率，从而判断Ca2+通道的功能。所以本实验使用不同的激动剂激活Ca2+通道，观察它们最大淬灭率，从而比较不同Ca2+通道的功能，该方法作用直接，代表性强，是研究Ca2+通道常用的方法。已知高血压过程中最主要的病理性改变就是平滑肌细胞内Ca2+转运障碍，血管张力增加，其中脑血管的改变时高血压时脑卒中最主要的因素，那么高血压过程中脑血管平滑Ca2+转运障碍和哪些Ca2+通道有关，本实验室的资料证明Rd可以抑制ET-1诱导的大鼠脑基底动脉平滑肌细胞的增殖，抑制高血压过程中BASMCs上CaCC电流的降低，同时研究也表明Rd可以明显抑制高血压过程中大鼠脑基底动脉和中脑动脉的重构，并且比VDCC的阻断剂Nim有更好的效果，三七人参皂甙Rd是否可以通过抑制Ca2+通道的功能而对高血压过程中脑血管的改变发挥作用呢。并且高血压常伴有内皮功能的紊乱，内皮细胞的损伤，本实验室的研究表明Rd可以保护牛主动脉内皮细胞缺氧/再复氧的损伤，保护高血压过程中大鼠主功脉的氧化应激。所以本实验研究三七人参皂甙Rd对高血压大鼠BASMCs上Ca2+通道的作用以及NO水平变化的影响。已有的资料表明Rd可以产生很多的生理作用：增强来源于神经干细胞的星型胶质细胞的分化、阻断缺氧/再复氧诱导的蛋白酪氨酸激酶的激活、降低间隙连接胞内信息的连接和氧化损伤、降低卡英酸诱导的小鼠死亡、诱导小鼠肾小球膜细胞的增殖、抑制压力诱导的IL—6水平的增加、抑制3-硝基丙酸诱导的纹状体的损伤，然而这些作用机理仍然不清楚。已知高血压过程中脑基底动脉上CaMKⅡ活性对胞内Ca2+转运起着非常重要的作用，那么Rd对高血压中的作用是否和CaMKⅡ的活性有关呢。所以本实验研究三七人参皂甙Rd对高血压大鼠脑基底动脉上CaMKⅡ活性的影响。 第一章三七人参皂甙Rd对高血压大鼠脑基底动脉平滑肌细胞Ca2+运动的作用 小结： 1.高血压过程中大鼠脑基底动脉平滑肌细胞上ROCC、SOCC和VDCC功能逐渐增强，与血压成正相关，且ROCC和SOCC增强的程度要大于VDCC。 2.三七人参皂甙Rd，可以完全阻止高血压大鼠脑基底动脉平滑肌细胞上ROCC和SOCC功能的增强，而对VDCC的变化没有作用。 第二章三七人参皂甙Rd对高血压过程中大鼠基底动脉NO水平变化的影响 小结： 1.高血压过程中大鼠脑基底动脉上NO的水平逐渐减少，且与血压成负相关。 2.三七人参皂甙Rd，可以部分阻止高血压时大鼠脑基底动脉NO水平的减少。 第三章三七人参皂甙Rd对高血压过程中大鼠脑基底动脉CaMKⅡ活性的影响 小结： 1.高血压过程中大鼠脑基底动脉上CaMKⅡ的活性逐渐增强，且与血压呈成正相关 2.三七人参皂甙Rd可以部分阻止高血压大鼠脑基底动脉上CaMKⅡ的活性的增强。 第四章三七人参皂甙Rd对高血压过程中大鼠血浆中AngⅡ和ET-1水平的影响 小结： 1.高血压过程中大鼠血浆中AngⅡ和ET-1的水平逐渐增强，且和血压成正相关， 2.三七人参皂甙Rd对高血压大鼠血浆中AngⅡ和ET-1的水平升高没有影响。 结论： 1.高血压过程中大鼠脑基底动脉平滑肌细胞上ROCC、SOCC以及VDCC功能逐渐增强，且ROCC和SOCC增强的程度要大于VDCC。三七人参皂甙Rd可以完全阻止ROCC和SOCC功能的增强，而对VDCC功能的增强没有作用。 2.高血压过程中大鼠脑基底动脉中NO的水平降低，三七人参皂甙Rd可以部分阻止NO水平的降低。 3.高血压过程中大鼠脑基底动脉中CaMKⅡ的活性逐渐增强，三七人参皂甙Rd可以部分阻止CaMKⅡ活性的增强。 4.三七人参皂甙Rd对高血压大鼠脑基底动脉Ca2+运动和NO水平变化的作用与大鼠血浆中AngⅡ、ET-1水平升高无关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语

声明

前言

第一章 三七人参皂甙Rd对高血压大鼠脑基底动脉平滑肌细胞Ca2+运动的作用

材料与方法

结果

讨论

小结

第二章 三七人参皂甙Rd对高血压大鼠脑基底动脉NO水平变化的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

第三章 三七皂甙Rd对高血压大鼠脑基底动脉Ca2+/Ca2+调素依赖性蛋白激酶Ⅱ活性的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

第四章 三七人参皂甙Rd对高血压大鼠血浆中血管紧张素Ⅱ和内皮素-1水平变化的作用

方法与材料

结果

讨论

小结

结论

创新与意义

附表

附图

参考文献

致谢