米诺环素及蛇床子素对C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用及机制研究

摘要

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是机体针对中枢神经系统(central nervous system，CNS)的髓鞘抗原、以中枢白质脱髓鞘为特征的自身免疫性疾病。多发于青壮年，呈慢性病程，迁延不愈。MS病因和发病机制尚未完全阐明，且缺乏确切有效的治疗手段。目前现有的治疗MS的药物包括糖皮质激素(glucocorticosteroids，GCS)、β—干扰素(interferon—β，IFN—β)、寡聚多肽(格拉默，glatiramer acetate，GA)、静脉注射免疫球蛋白(immunoglobulin'intravenous，IGIV)、米托蒽醌(mitoxantrone)等，这些药物主要针对MS患者的免疫功能进行调节，相当一部分患者治疗效果不好。开发新的治疗MS药物、开发已有药物的新用途或联用现有的MS治疗药物是当前MS药物治疗研究的热点。 第一章米诺环素联用强的松对实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用及机制研究 目的：米诺环素是第二代半合成的四环素类抗生素，具有抗炎、免疫调节和神经保护等药理学特性，目前已广泛应用于神经科多种疾病包括脑血管病(出血/缺血性)、脊髓损伤、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化等的治疗。近年来发现米诺环素对MS的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)有治疗作用，特别是在联用IFN—β、GA和阿托伐他汀(atorvastatin)之后。GCS具有强有力的抗炎及免疫调节作用，是MS急性复发期的常规治疗手段，但一些患者的治疗效果常因其伴随的副作用所限制，已有研究发现，联用GCS与其它药物如促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)和IGIV可以提高治疗效能及减少GCS用量。本研究的目的主要通过联用亚有效剂量的米诺环素和强的松(一种常用的合成的口服GCS)对EAE的作用及探讨其相关机制，为MS的治疗探索一种新的治疗手段。 方法：使用髓鞘少突胶质糖蛋(myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55amino acid peptide，MOG35-55)免疫C57 BL/6小鼠，复制EAE模型。在EAE小鼠发病后使用PBS、单用亚有效剂量米诺环素、单用亚有效剂量强的松及联用亚有效剂量米诺环素和强的松对EAE小鼠进行治疗，每日进行临床评分，观察EAE小鼠病情变化；在发病的急性期、复发期和慢性期对EAE小鼠行头颅核磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)检查，观察其影像学改变；同时在上述不同的疾病时期进行脑和脊髓的炎症、脱髓鞘检查评价其病理学的改变。使用逆转录多聚酶链反应(reverse transcriptional—polymerase chain reaction，RT—PCR)方法测定不同处理组小鼠皮质脑源性神经营养因子(brain—derived neurotrophic factor，BDNF)和神经生长因子(nerve growth factor，NGF) mRNA的表达情况。 结果：成功复制EAE模型，病情观察发现，与PBS治疗组比较，单用亚有效剂量的米诺环素或强的松不能减轻EAE症状，联合使用亚有效剂量的米诺环素和强的松可以有效减轻EAE病情，并抑制EAE的复发。影像学上发现，联用亚有效剂量的米诺环素和强的松较PBS组可以明显较少EAE急性期脑内病灶，在EAE复发及慢性期可以减轻血脑屏障(blood—brain barrier，BBB)炎症。在病理学上发现，联用亚有效剂量的米诺环素和强的松较PBS治疗组可以明显减少脊髓及脑部炎症细胞浸润和脱髓鞘。RT—PCR提示PBS治疗组的EAE小鼠脑皮质中BDNF和NGF的mRNA表达下调，联合用药可以阻止EAE小鼠脑皮质中BDNF、NGF mRNA的表达下调。 结论：联用亚有效剂量的米诺环素和强的松对EAE有明显的治疗作用；联用亚有效剂量的米诺环素和强的松对EAE的保护作用在临床表现、神经病理及影像学方面具有一致性；联用亚临床剂量的米诺环素和强的松可通过阻止EAE小鼠脑皮质中BDNF和NGF的mRNA的表达下调的机制对EAE起治疗作用 第二章蛇床子素对实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用及机制研究 目的：蛇床子素是由伞形科植物中提取分离出的天然香豆素类化合物，药理上具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和免疫调节作用，已用于抗心律失常、抗肿瘤、抗骨质疏松、扩张血管及改善循环(心脑血管)等治疗，具有可口服、副作用少和可长期使用等优点。近年来，蛇床子素的抗炎及免疫调节作用越来越被重视，已有研究发现：蛇床子素对于一些炎症及免疫性疾病如病毒性肝炎和类风湿性关节炎具有治疗作用。目前尚未见有蛇床子素对多发性硬化及其它T细胞介导的炎症性自身免疫性疾病治疗的报道。本研究的目的在于研究蛇床子素对MS的动物模型C57 BL/6小鼠EAE的作用及探索其可能机制。 方法：使用MOG35-55免疫C57 BL/6小鼠，复制EAE模型。在EAE小鼠免疫后7天(亚临床期蛇床子素治疗组)及13天(临床期蛇床子素治疗组)使用溶剂或蛇床子素对EAE小鼠进行治疗，每日进行临床评分，观察EAE小鼠的病情变化；在小鼠免疫后的第20天对EAE小鼠进行头颅MRI检查，观察其影像学改变：同时进行脊髓的炎症、脱髓鞘检查评价其病理学的改变。使用酶联免疫吸附试验(enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA)方法测定不同处理组小鼠血清及脾细胞培养上清中的NGF和γ—干扰素(interferon gamma，IFN—γ)的蛋白含量；使用RT—PCR方法检测不同处理组小鼠脑组织中NGF和IFN—γ mRNA的表达情况。 结果：与溶剂治疗组比较，亚临床期使用蛇床子素治疗可延迟EAE的发病，亚临床期和临床期使用蛇床子素对EAE有治疗作用，但在EAE小鼠的亚临床期使用蛇床子素的治疗效果优于在EAE小鼠的临床期使用蛇床子素的治疗效果。蛇床子素治疗可以减少EAE小鼠临床评分、颅内MRI病灶及改善其脊髓的炎症和脱髓鞘状况，这种治疗作用在亚临床期蛇床子素治疗组更为明显。在溶剂治疗组中，血清及脾细胞培养上清中NGF蛋白水平略下降，而IFN—γ分泌明显增多。使用蛇床子素治疗特别是在亚临床期使用蛇床子素治疗可使EAE小鼠血清中NGF蛋白水平升高、IFN—γ分泌下降。在亚临床期使用蛇床子素治疗可使EAE小鼠脾细胞培养上清中NGF蛋白水平上调；同时，使用蛇床子素治疗特别是在亚临床期使用蛇床子素治疗可使EAE小鼠脾细胞培养上清中IFN—γ分泌下降。RT—PCR提示溶剂治疗组的EAE小鼠脑中NGF mRNA表达下调和IFN—γmRNA分泌升高，使用蛇床子素可以阻止EAE小鼠脑中NGF mRNA的表达下调及抑制IFN—γ的分泌。 结论：在EAE疾病的亚临床期使用蛇床子素治疗推迟EAE小鼠的发病，在EAE疾病的临床期和亚临床期使用蛇床子素对EAE小鼠均有治疗作用。在EAE疾病的临床期和亚临床期使用蛇床子素对EAE的治疗作用在临床表现、神经病理及影像学方面具有一致性。蛇床子素可通过调节EAE小鼠血清、脾细胞培养上清和脑内的NGF和IFN—γ的蛋白和mRNA的表达/分泌而改善EAE小鼠的病情，对免疫反应和神经系统具有调节作用，可希望成为一种治疗MS的新药。 小结与展望：米诺环素联用强的松对C57 BL/6小鼠的EAE有治疗作用，可以减少两药的用药剂量从而减轻药物的副作用。在随后的研究中，可将米诺环素与其它糖皮质激素包括甲强龙联合，在一种或多种EAE模型上进一步验证其治疗效果，为该种联合用药的治疗方案在临床上的使用提供理论依据：蛇床子素对C57 BL/6小鼠的EAE有治疗作用，其机制可能与其调节免疫反应与神经系统有关，进一步的验证将在其它种属的EAE模型中进行。该实验结果提示中药提取物活性单体蛇床子素在神经免疫系统疾病的治疗中有潜在的优势和广阔的治疗前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词中英文对照

声明

前言

一、多发性硬化的发病机制

二、多发性硬化的治疗现状

三、EAE实验动物模型及评价指标

四、米诺环素的药物学特性、作用机制及在MS的应用前景

五、蛇床子素的药理学特性、作用机制及在MS的应用前景

六、本课题的研究内容

第一章米诺环素联用强的松对实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用及机制研究

目 的

实验材料和方法

结果

讨论

第二章蛇床子素对实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用及机制研究

目 的

实验材料和方

结果

讨论

结论与创新

本文的结论

本文的创新之处

本研究的不足之处

参考文献

攻读博士学位期间已发表的相关论文

综述米诺环素在多发性硬化中的应用进展

致谢