大鼠脓毒症肝损伤时巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白介素10(IL-10)的表达和意义

摘要

目的：脓毒症是由于感染而诱发的全身性炎症反应，是外科常见的并发症。脓毒症早期如果持续的全身性炎症反应得不到有效的控制，常常并发多脏器功能不全综合症(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，而MODS的终末表现是形成多脏器功能衰竭(multiple organ failure，MOF)，这是需要外科监护的重症患者死亡的主要原因。尽管现代外科监护技术和抗生素治疗有了很大发展，但是，脓毒症的死亡率仍然很高，文献报道在非休克患者中，其死亡率为30％—40％，而在休克患者中其死亡率则达到70％—90％，因此，脓毒症及其并发的脏器功能不全的防治，仍然是当代外科学领域的热点研究方向和尚待攻克的难题之一。 感染所致的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是大量促炎性细胞因子过度活化所引起的全身炎症反应已是多数学者的共识，近年来又发现在炎性细胞因子产生的同时伴有多种抗炎因子如白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素4(IL—4)等的释放，过量抗炎因子会导致代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti—inflammatory response syndrome，CARS)，继而导致过度的免疫抑制而使感染失控。最近的研究中，发现在促炎细胞因子中，巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitor factor，MIF)被认为是炎症发生发展的始动环节，它可以诱导生成多种炎性细胞因子的产生如肿瘤坏死因子(TNF—α)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL—6)等，从而引发炎症细胞因子的级联释放，进而对机体的炎症反应形成级联放大效应。IL-10是一种重要的内源性抗炎细胞因子，参与抑制细胞合成炎性因子，在脓毒血症的病理生理过程中起着维持炎症平衡，防止炎症过度而造成器官损伤的作用。本项目研究的目的在于为研究脓毒症肝脏损伤中此两种炎症因子的表达水平及损伤机制方面提供新的实验依据，为临床防治和预测脓毒症转归提供新的线索。 方法：1.应用盲肠结扎穿孔术(CLP)建立大鼠脓毒症病理模型。选用SD大鼠，3-5月龄，体重180-250克，雄性，由中山大学实验动物中心提供。将动物分为二组(实验组、对照组)，在不同时相(2h、6h、12h、24h)分别取材。2.取出部分肝脏组织置于10％的甲醛中固定，常规病理检查，HE染色，观察肝脏组织在不同时间组的过程中病理结构改变。另外一部分置于冻存管，—80℃低温冰箱保存。3.抽取大鼠血液，离心后提取血清，置于EP管放入—20℃冰箱保存。取出一部分应用血液生化分析方法检测各个时相组大鼠血液中ALT、TBIL的变化。4.按照酶联免疫吸附试验(ELISA)法试剂盒说明书步骤操作，最后置于酶标仪上检测其OD值，做出标准曲线计算血液中MIF、IL-10水平。 5.应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测肝脏组织MIF、IL-10在mRNA上的表达水平的变化：通过TRIZOL法提取肝脏组织RNA(Invitrogen)，逆转录为cDNA(Fermentas)，运用PCR仪扩增出DNA(体系25μl)： IL-10引物：上游5’—CTGGACAACATACTGCTAACCGAC—3’，下游5’—ATTCATTCATGGCCTTGTA—GACACC—3’，MIF引物：上游5'—CCGTGCCAGAGGGGTTT—3’，下游5’—GGCTGC—GTTCATGTCGTAA—3’，内参为β—actin。循环条件：94℃30sec，55℃30sec，72℃min，循环次数为33。完成扩增后在琼脂糖胶上电泳，置于凝胶成像仪上分析其灰度值。 结果：1.脓毒症早期出现外周血促炎细胞因子浓度增高，提示体内存在促炎细胞因子表达上调。在大鼠脓毒症模型中，我们观察到前促炎症因子MIF在造模后2h即升高(P<0.05)，6h达到峰值；抗炎因子IL-10在造模后2h逐渐升高(P<0.05)，在12h时达到浓度峰值。2.对肝脏标本行常规病理切片观察，观察到在2h、6h、12h、24h时肝脏病变逐渐加重，提示肝脏损伤随着脓毒症的进展而逐渐加重。3.对血清生化指标(ALT、TBIL)检测发现大鼠ALT、TBIL随着造模时间的延长而逐渐升高，提示肝脏损伤逐渐加重。4.CLP模型上可复制出脓毒症的临床及病理生理过程；从血清及组织炎性细胞因子的变化、器官功能损害和组织形态学损伤等不同的侧面都证实了脓毒症中促炎症因子MIF与抗炎因子IL-10之间的相关性(MIFmRNA/ IL-10mRNA：r=0.807 P<0.05，MIF/IL-10：r=0.655 P<0.05)，及与肝脏损伤密切相关(MIFmRNA/ALT：r=0.39 P<0.05，IL-10mRNA/ALT：r=0.545 P<0.05，MIF/ALT：r=0.49 P<0.05，IL-10/ALT： r=0.461 P<0.05，MIFmRNA/TBIL：r=0.596 P<0.05，IL-10mRNA/TBIL：r=0.553，P<0.05，MIF/TBIL：r=0.575，P<0.05，IL-10/TBIL：r=0.404，P<0.05)，这对脓毒血症的治疗及预后的判断具有一定临床意义。 结论：1.大鼠脓毒症模型组血清促炎因子MIF及抗炎因子IL-10与对照组相比有显著升高，分别在6h、12h达到峰值，可能在大鼠脓毒症肝损伤中起到一定作用。2.大鼠肝脏组织MIF、IL-10在mRNA水平上与其蛋白表达变化趋势一致，可能在大鼠脓毒症肝损伤中起到一定作用。

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综述 巨噬细胞移动抑制因子的最新研究

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