基于ABCG2及EGFR表达的肺癌细胞系中SP细胞的药物敏感性的初步研究

摘要

一.研究背景与目的： 目前由于有计划、合理地综合应用现有的几种治疗手段，肺癌的5年生存率有所提高，但仍有大部分病人死于局部复发或者远处转移。令人困惑的是这些情况又是手术、放疗及化疗等传统治疗所不能有效解决的。近年来研究发现肿瘤组织中存在一群数量少，但具有自我更新以及多向分化等一系列正常干细胞特征的细胞，且这类细胞具有很强致瘤性，这群细胞被命名为肿瘤干细胞(cancer stem cells or tumor stem cells，CSCs or TSCs)。从体外小鼠模型上得到启示，这类细胞有可能为肿瘤复发、分化及转移的重要原因[7]。 SP细胞(side population cell，SP cell，侧群细胞)是利用DNA荧光染料Hoechst33342和流式细胞技术发现的特殊细胞亚群，它们也具有自我更新、多向分化能力等一系列干细胞的生物学特征。目前已有报道在人体除造血系统外的多种正常组织和一些实体肿瘤中分离得到SP细胞，初步阐明了SP细胞的一系列生物学特征。但是迄今为止对人类肺癌中SP细胞的相关研究仍处于起步阶段。 随着对肿瘤干细胞研究的不断深入，在不同肿瘤细胞系以及原代组织标本中发现SP细胞的报道越来越多，但由于缺乏明确而统一的特异性细胞分型标记，在实体瘤干细胞的分离鉴定方面却存在着很大的困难。而利用SP细胞分离技术，研究肿瘤细胞中SP细胞的相关特性，将有助于人们了解真正的实体肿瘤干细胞，为肿瘤治疗提供新的指引。 二.研究方法： 将生长状态良好的肺癌细胞株经DNA荧光染料Hoechst—33342染色后进行流式细胞仪无菌分选，分别收集荧光阳性的Non—SP(non side population cell，Non—SP cell，非侧群细胞)细胞和荧光阴性的SP细胞。收集分选后培养一段时间的细胞，经过ABCG2抗体标记后上流式细胞仪分析，验证SP及Non—SP细胞表面ABCG2抗原表达。同时利用流式细胞仪测定SP及Non—SP细胞表面EGFR家族各成员蛋白表达。经过以上方法后，我们以MTT方法检测临床上常用的化疗药及靶向药物对SP细胞及Non—SP细胞的细胞毒作用。观察它们的反应性差别，以期为临床应用提供依据。 三.结果： 肺癌细胞株Glc—82中荧光阴性的SP细胞比例为14.5％，其他均为Hoechst33342荧光阳性的Non—SP细胞。对照组经过Verapamil处理后发现SP细胞降低到3.6％。收集分选后培养一段时间的细胞，经过ABCG2抗体标记后上流式细胞仪分析，发现SP细胞表面ABCG2抗原阳性的细胞达到2.5％，而Non—SP细胞中该抗原阳性的只有0.6％，差异明显(P<0.05).利用流式细胞仪测定SP及Non—SP细胞表面EGFR蛋白表达，发现除c—erbB1表达在SP细胞中(1.33％)高于Non—SP细胞表达(0.7％)外，具有统计学差异(P<0.05)。其他成员cerbB2-4均无明显的统计学差异。我们用临床上常用的化疗药及靶向药物进行实验，分为六组进行：以MTT实验检测各药：carboplatin组、cisplatin组、Lapatinib组、vinorelbine组、Paclitaxel组及docetaxel组对SP细胞及Non—SP细胞的细胞毒作用。结果表明，各组化疗药对SP细胞的抑制作用均小于Non—SP细胞，重复测三次数值并行配对T检验(P<0.002)。同时采用MTT法重复三次测每组IC50值(图2.1.4 G)，并行配对T检验差异显著(P<0.05)。采用SPSS13.0进行统计学分析 四.结论： 本论文初步探索利用FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter，FACS)的技术，基于ABCG2和EGFR蛋白表达在中国人肺腺癌细胞系Glc—82中的特点，研究肿瘤干细胞样SP细胞药物敏感性及得出以下结论： 一、中国人肺腺癌细胞系Glc—82中存在SP细胞亚群。其表面ABCG2分子高表达于Non—SP细胞。 二、中国人肺腺癌细胞系Glc—82中SP细胞普遍对化疗药及EGFR靶向药物耐药。 三、中国人肺腺癌细胞系Glc—82中SP细胞表面EGFR家族各成员表达不具有明显差异。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

1.肿瘤干细胞及SP细胞(Side population cell)

2.肺癌及其他实体肿瘤干细胞研究进展

3.本论文的研究目的及意义

第一章材料与方法

1.1实验技术路线及研究内容介绍

1.2实验材料及试剂配制

1.3实验方法

第二章 结果

2.1 S P细胞的分选

2.2 ABCG-2蛋白水平的表达

2.3 EGFR家族蛋白表达

2.4化疗敏感性实验

第三章讨论

第四章结论

参考文献

致谢