日本血吸虫病无创型诊断试剂盒开发的前期研究

摘要

日本血吸虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病，也是我国重点防治的重大疾病之一。血吸虫病的主要危害在于血吸虫虫卵导致的肉芽肿及其组织的纤维化，患者在晚期可出现肝脾肿大、门脉高压和腹水等严重的临床症状，晚期患者会丧失劳动力甚或死亡。因此，血吸虫病及时诊治具有重要的临床意义。 血吸虫病诊断常用方法主要有病原学和免疫学方法。由于病原学检查费时耗力，且漏检率高，免疫学方法已成为目前现场查病的主要辅助诊断方法，且主要是以检测血清中特异性抗体的血清学方法，如ELISA、IHA等。但是在血吸虫病疫区，反复的有创性采血，当地居民的依从性越来越差。而唾液作为诊断样本因其采集简单方便且无创越来越受到关注。已有研究结果提示研发以唾液作为检测样品的无创性诊断试剂盒是可行的。 目前用于血吸虫病免疫诊断的抗原主要是血吸虫粗抗原，但粗抗原制备困难，存在一定的交叉反应，且不易标准化，导致检测试剂批间质量不稳定。近年来，随着基因重组技术以及生物信息学的日益发展，可对具有诊断价值抗原的组分及性质进行分析鉴定，再通过重组表达纯化，应用于诊断。为此，我们利用感染者唾液中特异性的IgG作为探针，对已构建的日本血吸虫虫卵cDNA文库进行了免疫学筛选。应用生物信息学分析技术，对阳性克隆的插入片段进行序列分析，从中挑选具有诊断价值的抗原基因进行克隆表达，并对其免疫学特性以及诊断价值进行了初步验证，为进一步研制无创性血吸虫病诊断试剂盒提供实验基础。 研究目的： 获取能被日本血吸虫感染者唾液中特异性抗体所识别的日本血吸虫抗原基因，并完成基因重组表达以及重组蛋白诊断价值评价，为研制能应用于现场的无创型快速筛查诊断试剂盒奠定研发基础。 研究内容和方法： 1.日本血吸虫虫卵cDNA文库的免疫学筛选及其阳性噬菌体插入cDNA片段的序列分析 1.1利用日本血吸虫病人唾液筛选日本血吸虫虫卵cDNA文库，获得阳性噬菌体，并经两次复筛，选出强阳性克隆作为候选克隆。 1.2采用多聚酶链反应(PCR)技术扩增出候选噬菌体的插入片段，运用直接测序技术测定插入cDNA片段的核苷酸序列，经编辑后的序列通过NCBI(the National Center for Biotechnology Information)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLASTN，BLASTX软件进行分析。 2.候选基因的表达以及免疫学特性分析 2.1 PCR扩增侯选基因开放读码框，克隆到载体pET32a(+)中，并进行诱导表达、纯化重组蛋白后对重组蛋白进行质谱鉴定。 2.2以血吸虫感染者的血清和唾液以及非感染者的血清和唾液作为免疫探针，以重组蛋白作为抗原进行Western blot。 2.3用纯化的重组蛋白免疫小鼠，制备抗血清，以该血清作为探针，对重组蛋白和血吸虫不同发育时期的可溶性蛋白进行Western blot。 2.4设计侯选基因的特异性引物，提取日本血吸虫虫卵、尾蚴、成虫的总RNA并反转录合成相应的cDNA，采用RT-PCR对候选编码基因在不同虫期的相对表达水平进行分析。 3.间接ELISA反应条件优化及其诊断价值初步鉴定 3.1以纯化融合蛋白为抗原，包被酶联免疫反应板，用间接ELISA法检测日本血吸虫感染者以及非感染者血清以及唾液。摸索最适抗原包被浓度、最适封闭液和封闭时间、最适血清反应时间、浓度以及反应温度、最适二抗工作浓度、最适显色时间条件。 3.2用已优化的ELISA检测体系以及AWAP作为包被抗原对日本血吸虫感染者、非感染者的血清和唾液进行检测，评价其敏感性和特异性。 研究结果： 1、日本血吸虫虫卵cDNA文库的免疫学筛选以及阳性噬菌体插入cDNA片段的序列分析 1.1日本血吸虫虫卵cDNA文库的免疫学筛选鉴定 以直径为9cm平板含约近4×102个噬菌斑的密度进行初筛，获40多个初筛阳性噬菌体。初筛阳性噬菌体再复筛2次，最后挑取持续强阳性噬菌体21个。15个强阳性噬菌体扩增出特异条带，但其中8个扩增片段大于500bp。取8个PCR产物送去测序，经Clustalw分析，去除重复序列后，最后得到7条待分析的cDNA序列。 1.2阳性噬菌体插入cDNA片段的序列分析 采用BIASTN和BLASTX与NCBI的GenBank中的已知DNA序列和蛋白质序列进行同源性检索。结果发现，在待分析的7条cDNA序列中，与其它物种已知序列同源的序列有2条，未发现同源序列的有3条，与已知日本血吸虫序列同源的序列有2条，其中一序列BLASTX分析结果显示，所推导的氨基酸序列为日本血吸虫毛蚴相关蛋白，其理论分子量约为13kDa将该基因暂时命名为日本血吸虫毛蚴相关蛋白(Miracidia associated protein of Schistosoma japonicum，SjMP13)基因。 2、SjMP13基因的表达以及免疫学特性分析 2.1编码基因的扩增、克隆和重组表达 根据GenBank中AY222893.1的序列信息，设计PCR引物扩增SjMP13的ORF，进而将获得的目的基因片段定向克隆到pET32a(+)质粒中，经PCR、酶切及测序验证该目的基因克隆成功。将成功构建的重组子pET32a(+)—SjMP13经IPTG诱导表达，在较宽的温度范围和IPTG诱导浓度范围内都获得了很好的表达；His亲和层析柱纯化的重组表达产物(rSjMP13)分子大小为35kDa经质谱鉴定，证明是SjMP13蛋白。 2.2 SjMP13转录水平分析 提取日本血吸虫尾蚴、成虫以及虫卵的总RNA并反转录合为cDNA，采用RT—PCR对SjMP13编码基因在不同虫期的相对表达水平进行分析。实验结果显示，SjMP13基因在不同发育期均有转录且转录水平相近。 2.3 rSjMP13抗原性以及免疫原性的分析 ①rSjMP13抗原性分析以制备的rSjMP13多抗血清为一抗进行Western blot，结果显示在日本血吸虫虫卵、尾蚴、成虫粗提抗原均识别到一大小在55-72kDa之间的条带，但其理论分子量约为13kDa。 ②rSjMP13免疫原性分析纯化后的重组蛋白能分别被日本血吸虫感染者唾液和血清所识别，在35kDa左右处均可见一条明显的免疫反应带，而阴性对照血清以及唾液在相应的位置未识别出该蛋白条带。 3、间接ELISA反应条件优化及其诊断价值初步鉴定结果 建立并优化ELISA方法，最佳包被浓度为7.5μg/mL，最适封闭条件为5％脱脂牛奶37℃封闭1或1.5h；最适血清反应条件为1:200稀释37℃温育90min；酶标二抗1：25000稀释37℃温育1h；以TMB显色2min左右为佳。间接ELISA方法对标准血清以粗抗原为包被抗原检测敏感性为95％，特异性为85.53％，符合率88.79％；以SjMP13为包被抗原检测感染者以及非感染者的唾液敏感性为92.5％，特异性为92.11％，符合率为92.24％。 研究结论： 采用免疫学筛选及分子克隆技术，以唾液中特异性IgG为探针从日本血吸虫虫卵cDNA文库中分离到毛蚴相关蛋白基因(命名为，SjMP13)，并成功构建了该基因的高效原核重组表达体系。Western blot结果初步显示rSjMP13具有较好的抗原性和免疫原性。以该分子作为抗原检测血吸虫感染者唾液中特异性IgG具有较高的特异性和敏感性。本研究初步证明rSjMP13在日本血吸虫病无创性诊断试剂盒的研发中具有潜在的价值，值得进一步研究开发。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩写词

声明

前言

第一章唾液筛选日本血吸虫虫卵CDNA文库以及阳性克隆序列分析

1材料

2方法

3结果

4讨论

第二章SjMP13基因重组表达及其免疫学特性分析

1材料

2方法

3结果

4讨论

第三章rSjMP13诊断抗原研发价值的实验评价

1材料

2方法

3结果

4讨论

总 结

参考文献

附录

在读期间发表或已撰写论文

致谢