戊巴比妥钠抗大鼠C6恶性胶质瘤细胞的作用及其机制研究

摘要

恶性胶质瘤是严重威胁人类健康的疾病，是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤。目前，对于恶性胶质瘤仍缺乏有效的治疗手段。虽然采取手术切除，放射治疗等方法，但由于胶质瘤本身的浸润性生长特点和对放射治疗的不敏感，使得胶质瘤患者的预后并不乐观。化学治疗目前虽然只是胶质瘤治疗的辅助方法，由于化学治疗药物的多样性，具备选择性作用于肿瘤细胞的可能性，使得化学药物治疗成为胶质瘤治疗的研究热点。然而，由于血脑屏障的存在，使得许多体外对胶质瘤有效的药物难以进入脑组织达到有效治疗浓度。因此，寻找能顺利通过血脑屏障并且能有效的治疗恶性胶质瘤的小分子药物成为化学治疗的核心。 巴比妥类药物是一类临床上常用的镇静催眠药。其作用的主要靶器官是中枢神经系统，具备极好的溶解性及通过血脑屏障的能力。但巴比妥类药物对肿瘤，特别是胶质瘤的作用报道较少且结论不一。 本研究对经过戊巴比妥钠（Pentobarbital）处理的大鼠C6恶性胶质瘤细胞株进行检测，观察Pentobarbital对C6细胞增殖，分化，迁移，侵袭及细胞骨架的影响，探讨其可能的作用机制，并进一步在大鼠大脑皮层原位接种C6胶质瘤细胞的方法上研究Pentobarbital对体内胶质瘤生长的影响，为临床寻找有效治疗恶性胶质瘤的小分子药物提供新的思路。 第一章戊巴比妥钠对恶性胶质瘤细胞增殖及分化的影响 方法：大鼠C6胶质瘤细胞的培养；相差显微镜（phasecontrastmicroscopy）及透射电镜（transmissionelectronmicroscopy）观察Pentobarbital作用前后的形态及细胞内部的超微结构；甲基偶氮唑蓝比色（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT）法检测细胞增殖能力；乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）法检测细胞毒性；Hoechst33258染色和AnnexinV-PI双染法检测细胞凋亡；流式细胞仪（flowcytometry）检测细胞周期（cellcycle）；Westernblot检测细胞周期蛋白cyclinD1，cyclinD3，CDK2，CDK4，CDK6，pRb，P21，以及PCNA，GFAP的蛋白水平；定量实验结果以x±S表示，采用t检验和方差分析。 结果：Pentobarbital引起大鼠C6胶质瘤细胞株出现显著的形态学变化，细胞增殖抑制，G1期阻滞，S期及G2/M期减少，细胞周期相关蛋白CyclinD1，CyclinD3，CDK2，p-Rb下调，GFAP表达增加，PCNA表达下降，同时细胞不发生凋亡和死亡。 结论：Pentobarbital能抑制大鼠C6胶质瘤细胞增殖并诱导其分化。 第二章戊巴比妥钠对大鼠C6恶性胶质瘤细胞骨架及功能学方面的影响。 方法：大鼠C6胶质瘤细胞培养；相差显微镜和激光共聚焦显微镜（confocal）观察细胞形态和细胞骨架的变化；WesternBlot法检测微管的聚合和解聚状态；划痕实验法检测迁移能力；transwell小室法检测侵袭能力。 结果：Pentobarbital可诱导大鼠C6胶质瘤细胞出现可逆的形态学变化，这种形态学变化可被RhoA/ROCK通路抑制剂Y27632部分模拟且被该通路激活剂凝血酶（Thrombin）部分阻断，confocal及westernblot结果显示Pentobarbital可抑制微管聚合，划痕实验及transwell小室检测结果显示Pentobarbital可抑制大鼠C6细胞的迁移及侵袭。 结论：Pentobarbital可诱导C6细胞出现显著的形态学变化，这种形态学变化可能与细胞骨架的改变有关。Pentobarbital能抑制C6细胞的迁移和侵袭。 第三章戊巴比妥钠对大鼠C6胶质瘤细胞内信号通路的影响及其机制的探讨 方法：大鼠C6胶质瘤细胞培养；相差显微镜观察细胞形态；MTT法检测细胞增殖；WesternBlot法检测Pentobarbital对MAPK，P13K/AKT，PKA/CREB，JAK/STAT3信号通路以及PTEN，GSK，P53信号分子的影响；利用RAS/MEK/ERK通路抑制剂U0126，PD98059，PI3K/Akt通路抑制剂LY294002以及siRNA干扰PCNA的方法检测这些通路对分化的影响。 结果：Pentobarbital引起的C6细胞形态学变化和增殖抑制不能被GABAa受体激动剂GABA，安定（Diazepam），Muscimol所模拟，也不能被GABAa受体阻断剂bicuculline所阻断，Pentobarbital能抑制RAS/RAF/MEK/ERK，JNK/c—JunMAPK和PI3K/AKT信号通路，但不能激活或抑制PKA/CREB，JAK/STAT3信号通路，同时对PTEN，GSK，P53等信号分子也无明显影响，RAS/MEK/ERK通路抑制剂U0126，PD98059和PI3K/AKt通路抑制剂LY294002不能诱导C6细胞分化，干扰掉PCNA能引起C6细胞分化。 结论：Pentobarbital对C6细胞的形态学改变和增殖抑制不依赖于其GABAa受体功能，可能与RAS/RAF/MEK/ERK，JNK/c—JunMAPK和PI3K/AKT信号通路有关。Pentobarbital诱导的胶质瘤细胞分化可能与降低PCNA的表达有关。 第四章戊巴比妥钠对大鼠大脑皮层原位接种C6胶质瘤细胞的体内实验研究 方法：在脑立体定位仪的帮助下，在大鼠大脑近皮层原位接种C6恶性胶质瘤细胞制作胶质瘤的原位接种体内模型，并研究Pentobarbital对大鼠大脑皮层原位接种胶质瘤模型的影响，观察指标为死亡率和肿瘤体积大小。 结果：成功制作大鼠大脑近皮层C6恶性胶质瘤细胞的体内模型，模型成功率为90％。模型组和Pentobarbital治疗组30天死亡率分别为40％和53％，肿瘤体积大小分别为212.5±85.6mm3和200.5±78.5mm3，两者无统计学差异。 结论：Pentobarbital对大鼠大脑近皮层C6恶性胶质瘤细胞的体内模型无治疗作用。

目录

文摘

英文文摘

论文产明：主要英文缩写词表

声明

前 言

第一章 戊巴比妥钠对大鼠C6恶性胶质瘤细胞增殖和分化的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二章 戊巴比妥钠对大鼠C6恶性胶质瘤细胞骨架及功能学方面的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三章 戊巴比妥钠对大鼠C6胶质瘤细胞内信号通路的影响及其机制的探讨

引言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四章 戊巴比妥钠对大鼠大脑皮层原位接种C6胶质瘤细胞的体内实验研究

引言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附录

第一部分 重组蛇毒纤溶酶rFII对免疫性肝损伤的作用研究

第二部分 神经元缺氧相关基因的克隆与腺病毒载体的构建

引言

第1章 海洋甾体化合物YC-1对缺氧诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

第2章 对小脑颗粒神经元缺氧的基因芯片部分结果的验证

第3章 胰腺炎相关蛋白(Pancreatitis-Associated Protein)腺病毒载体的构建

参考文献

在学期间论文发表情况：

致谢