中国南海信号芋螺毒素It14a的药理毒理学研究

摘要

芋螺毒素是生物毒素中迅速发展的新领域，是很有价值的药物或药物先导化合物。本文以中国南海信号芋螺lt14a为研究对象，利用分子生物学、电生理学、药理学和毒理学等方法对这种信号芋螺毒素进行了较为系统的药理毒理学研究。 实验室前期的研究中，发现了新L芋螺毒素基因超家族的lt14a。lt14a是一条具有13个氨基酸、两对交叉式连接的二硫键和一个C末端酰胺化修饰的小肽，其分子量为1391.08道尔顿。通过生物信息学分析表明，lt14a与α芋螺毒素qc1.1具有前体肽特别是两者前导肽区的C末端氨基酸序列上的相似性，但从“C—C—C—C”框架来看，lt14a又和J—超家族类似。实验初期利用固相合成的信号芋螺毒素lt14a进行了小鼠热板镇痛实验显示有一定的镇痛活性，通过研究发现其作用靶点为乙酰胆碱受体。 本论文通过固相化学合成的方法合成了纯度为98.8％的lt14a，圆二色谱分析表明，所合成的信号芋螺毒素的二级结构中不含有β—sheet结构，由α—helix结构和Random结构组成，其二级结构的组成与J超家族中的p114a二级结构相类似。 应用分子生物学技术将编码人源性烟碱型乙酰胆碱受体α3和β4亚基之cDNA，分别重组于真核细胞表达质粒（expression plasmid） pcDNA3.1和pcDNA3.0上，通过转染技术，把重组后的pcDNA3.0和pcDNA3.1导入HEK293细胞，使其细胞膜上稳定表达具有功能的人源性α3β4亚型的烟碱型乙酰胆碱受体。应用全细胞膜片钳（patch clmap）技术测量转染细胞（transfection cells）对It14a的反应，发现It14a在10μM和100μM浓度下对乙酰胆碱（Ach）诱发的全细胞电流有一定的抑制作用。在蛙坐骨神经（sciatic nerve）—腓肠肌标本上检测It14a体外组织水平活性，100μM浓度的It14a能有效阻断神经传导，抑制腓肠肌（gastrocnemius）对电刺激神经的收缩反应（contractile response）。 利用膜片钳技术，研究It14a对急性分离的SD大鼠背根神经细胞膜中的钠离子通道和钾离子通道的电流的影响，记录结果显示100uM的毒素蛋白对这两种通道的电流没有任何影响，表明It14a作用的“靶标”分子具有较强的专一性，为进一步阐明It14a药理学属性奠定了基础。 运用小鼠急性毒性试验模型对其进行动物整体水平的毒性研究，对实验小鼠血液生化指标进行测定，实验结果表明：当注射药物浓度高达有效镇痛裁量1400倍时，小鼠血液中的谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、尿酸（UA）、和尿酸（UREA）浓度比正常组浓度偏高。结合病理组织学方法观察，发现It14a对脑组织、肾脏、和心脏损伤不严重，肝脏和肺在注射药物后期表现出一定的损伤。 总之，对新毒素It14a药理毒理学研究工作的开展，为该药物进入临床研究提供了基本的数据，同时对加深L超家族芋螺毒素特性的认识具有重要的生物学意义。

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文摘

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论文说明：缩略语

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第一章 绪论

1.1研究背景

1.1.1芋螺

1.1.2芋螺毒素

1.1.3芋螺毒素的作用靶点

1.1.4芋螺毒素的药用前景和开发技术

1.2研究目的和意义

1.3技术路线

第二章信号芋螺毒素It14a的固相化学合成和质量标准研究

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.3 讨论

2.4小结

第三章信号芋螺毒素It14a镇痛机理的探讨

3.1 It14a在组织水平上的活性检测--蛙坐骨神经-腓肠肌标本法

3.1.1材料与方法

3.1.2结果与分析

3.1.3讨论

3.1.4小结

3.2 It14a镇痛靶点亚型的研究

3.2.1材料与方法

3.2.2实验结果

3.2.3讨论

3.2.4小结

3.3信号芋螺毒素It14a对钠离子和钾离子通道的作用

3.3.1材料与方法

3.3.2结果与分析

3.3.3讨论

3.3.4小结

第四章信号芋螺毒素It14a的毒理学研究

4.1芋螺毒素It14a的体外细胞毒性研究

4.2芋蝶毒素It14a对整体动物的毒性研究

4.2.1材料与方法

4.2.2药物毒性小鼠模型建立

4.2.3统计处理

4.2.4结果与分析

4.2.5讨论

4.2.6小结

总结与展望

参考文献

附录

致谢