发干线粒体DNA提取改良法的建立、缺失类型的筛选及其缺失量与年龄的关系

摘要

毛发是犯罪现场上最常见的物证检材之一。发干的传统方法检验主要集中在形态学的对比上。随着毒化技术和分子生物学技术的发展和运用，发干分析检验内容已经成功地扩展到毒化分析和个人识别领域。但目前，对于发干的年龄推断仍然没有可靠有效的方法。不带毛囊的发干的主要成分是角质蛋白和微量的线粒体DNA。线粒体DNA缺失在衰老过程中扮演着重要的角色，并且其缺失量有随着年龄增加而增加的趋势，因而，线粒体DNA缺失或许可以成为发干年龄推断研究的切入口。 前期的研究已经证实，mtDNA的多种大片段缺失与年龄存在密切的关系，例如：13162bp、7663bp、7634bp、10422bp、4989bp和4977bp缺失等。但这些缺失类型是否存在于发干当中、其缺失量与发干的年龄关系如何仍然未见系统的研究报道。 此外，从发干中提取线粒体DNA仍然是一个难点，虽然国内外文献均有相关方法的研究报道，但在实际运用中均存在缺点。分析发干提取中的影响因素及建立适合本实验的方法是研究毛发mtDNA缺失情况的前提条件之一。 研究目的： 本研究主要探讨发干中提取mtDNA的方法、发干中mtDNA缺失类型及其缺失量与年龄的关系： (1)对比多种从发干中提取mtDNA的技术，并建立经济、高效和适合本实验的方法。 (2)明确发干中是否存在线粒体DNA13162bp、7663bp、7634bp、10422bp、4989bp和4977bp缺失，以探讨缺失类型及其缺失发生率与年龄的关系。 (3)分析不同年龄发干线粒体DNA缺失的量，明确缺失量与年龄的关系，探讨mtDNA缺失实时定量技术在发干年龄推断中的运用价值，尝试建立毛发年龄推断的新指标。 主要研究的内容及结果 第一部分多种发干mtDNA提取方法的对比及改良方法的建立 1.1.利用chelex-100法对20份无染色发干mtDNA进行提取和PCR扩增，其扩增成功率为75％。 1.2利用NaOH法对20份无染色发干mtDNA进行提取和PCR扩增，其扩增成功率为70％。 1.3利用压发机对发干进行碾压破坏其外层蛋白结构后，采用自配消化液(100mmol/l Tris—HC1,1mmol/l EDTA,1％ TritonX-100,1mg/ml蛋白酶K,80mmol/l DTT)进行发干消化，建立改良法。对20份无染色发干mtDNA进行提取和PCR扩增，其扩增成功率为90％。 1.4利用NaOH法对10份染色发干mtDNA进行提取和PCR扩增，其扩增成功率为50％。 1.5利用chelex-100法结合Microcon100纯化柱对10份染色发干mtDNA进行提取和PCR扩增，其扩增成功率为80％。 1.6单纯利用改良法对10份染色发干mtDNA进行提取和PCR扩增，其扩增成功率为20％。结合DNA吸附纯化柱纯化后，其扩增成功率为80％。 第二部分发干mtDNA缺失类型的筛选 2.1针对4977bp缺失类型，在缺失位点两侧设计特异性引物对90份不同年龄的发干进行PCR筛选，并对阳性模板进行测序认证。有89份样品检测到4977bp缺失，其缺失发生率为98.9％，测序结果显示其缺失片段大小为4977bp，与理论值一致。 2.2针对13162bp、7663bp、7463bp、10422bp和4989bp等缺失类型，在缺失位点两侧设计特异性引物对90份不同年龄的发干进行PCR筛选，均未发现其PCR扩增产物。 2.3对阴性模板的扩增条件进行优化，在采取更换PrimeSTAR HS DNAPolymerase、提高Mg2+浓度、采用二次扩增的方法等提高扩增体系灵敏度等措施后，仍未检见13162bp、7663bp、7463bp、10422bp和4989bp缺失的目的片段。 第三部分mtDNA4977bp缺失实时定量PCR探针法的建立与不同年龄发干缺失量的分析 3.1分别扩增mtDNA4977bp缺失和MTND1基因，并连接到PMD-19 T载体上，经过蓝白斑筛选、PCR扩增筛选和测序认证，成功构建mtDNA4977bp缺失重组质粒和MTND1重组质粒。 3.2分别以MTND1和mtDNA4977bp缺失标准品进行10的倍数稀释后，取六个浓度进行扩增(从1×10-5 pg至1 pg)，MTND1标准品的CT值与起始模板量的关系公式为y=-1.34ln(x)+17.54，R2=0.9977，R2>0.99，两者之间具有良好的依存关系；mtDNA4977bp缺失标准品的CT值与起始模板量的关系公式为y=-1.37ln(x)+18.11，R2=0.9984，R2>0.99，两者之间具有良好的依存关系； 3.3对90份从5天至91岁的不同年龄发干样品进行mtDNA4977bp缺失定量，共有89份样品检测到mtDNA4977bp缺失，阳性率为98.9％，缺失量为0至1.436％±0.2086％之间， 3.4统计学分析显示mtDNA4977bp缺失与年龄之间存在一定的相关性(r=0.639，P<0.05)，并且有随着年龄的增长而增长的趋势。数学模型建立中最佳的关系公式为y=2E—05e0.042x(R2=0.408, P<0.05)。 结论： 1.在非染色发干提取中，本实验建立的改良法的PCR扩增成功率高于chelex-100法和NaOH法，并且成本低廉，适合大样品提取使用。 2.在染色发干提取中，改良法结合DNA吸附纯化柱的PCR扩增成功率与chelex-100法结合Microcon100纯化柱无统计学差别，但成本更为低廉，仅为后者的1/10。 3.本实验90份发干样品中未检测到线粒体DNA13162bp、7663bp、7463bp、10422bp和4989bp缺失。 4.线粒体DNA4977bp缺失是在发干样品中普遍存在，并且在20岁以下的发干样品中具有很高的发生率。 5.发干中mtDNA4977bp缺失量有随着年龄的增长而增加的趋势，两者的相关性为r＝0.639 6.发干中mtDNA4977bp缺失量与年龄之间的最佳数学模型公式为：y=2E—05e0.042x(R2=0.408，P<0.05)，mtDNA4977bp缺失量在同一年龄间存在一定的变异性。 7.mtDNA4977bp缺失可以成为发干年龄推断的潜在指标。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写词表

声明

前 言

第一部分 多种发干mtDNA提取方法的对比及改良法的建立

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨 论

四、小 结

第二部分 发干mtDNA缺失类型的筛选

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨 论

四、小 结

第三部分 mtDNA4977bp缺失实时定量PCR探针法的建立及不同年龄发干缺失量的分析

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨 论

四、小 结

参考文献

附录

感谢语