毛干中线粒体DNA4977bp缺失突变与老年性聋功能损害程度的关系

摘要

目的:
　　通过检测人毛干线粒体DNA的状态及缺失突变情况，探讨毛干线粒体DNA4977bp缺失突变与老年性耳聋的关系，进一步阐明毛干线粒体DNA的获得性损伤在老年性耳聋发病中的意义。
　　方法:
　　1、病例选择:收集山东大学附属省立医院耳鼻咽喉头颈外科门诊2013年6月至2013年11月就诊的老年性耳聋患者，通过问卷调查和严格的听力筛查项目（纯音听阈和鼓室图）来收集样本。纳入研究标准:受试者必须是双侧、感音神经性听力损失;受试者双侧听力在同一频率差异在10分贝以内;每个受试者纯音听阈阈值增加26分贝以上;每位受试者鼓室图显示没有明显其它能引起听阈增高的病变。调查问卷详细地包括了受试者以往的药物史、家族史、既往及现病史，排除有明确的其它引起听力损失疾病的就诊者。
　　2、毛干总线粒体DNA的提取:每位纳入研究的受试者收集4-6根毛干，使用chelex-100法提取毛干中线粒体DNA。
　　3、普通PCR:使用普通PCR方法进一步验证毛干中线粒体DNA提取成功。
　　4、巢式PCR:采用巢式PCR检测患者毛干中线粒体DNA状态及线粒体DNA4977bp缺失比率。
　　5、DNA测序:使用ABI3730型自动测序仪对巢式PCR扩增的DNA缺失片段进行测序，进一步验证缺失片段为线粒体DNA4977bp。
　　6、实时定量荧光PCR.:检测受试者毛干中线粒体DNA4977bp缺失程度，观察线粒体DNA4977bp缺失突变率与老年人群听力功能受损程度的关系。
　　结果:
　　1、经过严格听力检测及问卷调查标准筛选的87例单纯性老年性耳聋患者（60-83岁）和95例听力正常老年人（63-81岁）为对象，每位受试者收集4-6根毛干。
　　2、普通PCR结果显示:所有标本均可扩增出135bp线粒体DNA保守片段，表示每位受试者毛干提取DNA均为线粒体DNA。
　　3、巢式PCR结果显示:线粒体DNA4977bp缺失突变阳性标本首次PCR可以扩增出618bp的目标片段，而未发生缺失突变的DNA样本由于Taq酶功能的限制和延伸时间不足的限制不能扩增出长约5kb的片段;经首次PCR证实缺失突变阳性的标本，再次PCR，可扩增出396bp的目标片段。老年性聋组线粒体DNA4977bp缺失突变发生率为59/87。其中，听力损失在26-55dB之间，表现为轻中度听力损失患者，缺失突变发生率为22/43;听力损失在56-90dB之间以全频损失，表现为中重度、重度听力损失患者，缺失突变发生率为25/31;听力损失＞90dB，表现为极重度听力损失的患者，缺失突变发生率为12/13。而听力损失＜26dB，表现为听力正常组线粒体DNA4977bp缺失突变发生率8/95。Pearson相关系数分析结果显示，线粒体DNA4977bp缺失突变与听力损失严重程度之间存在着明显相关性(r=0.858;P＜0.050);卡方分析结果显示不同组之间线粒体DNA4977bp缺失突变阳性率有明显统计学差异(F=47.145;P=0.000)。
　　4、经ABI3730型自动测序仪对巢式PCR扩增的DNA缺失片段进行测序，结果显示缺失片段为线粒体DNA4977bp。
　　5、实时荧光定量PCR表明:轻中度听力损失组，中重度、重度听力损失组，极重度听力损失组及正常听力组线粒体DNA缺失量分别为11.97±4.12％、19.75±5.29％、33.68±10.30％、4.91±4.16％。四组之间的差异有明显的统计学意义(P＜0.050)，而且老年性耳聋患者存在线粒体DNA4977bp缺失，且听力损失越严重，缺失量越明显(P＜0.050)。在8kHz(r=0.778，P＜0.050)和各频率平均听力损失(r=0.858，P＜0.050)患者均表现出该现象。
　　结论:
　　1、老年性耳聋患者及正常听力老年人群毛干中均存在线粒体DNA4977bp缺失突变;
　　2、老年性耳聋患者毛干线粒体DNA4977bp缺失突变率明显高于正常听力老年人群;
　　3、老年人群听力功能受损程度与患者毛干线粒体DNA缺失突变量呈正相关。