NF-κB、EGFR、MUC1在肝内胆管结石合并肝内胆管癌组织的表达和意义

摘要

胆管癌的发病率在全世界呈上升趋势，约1/3的胆管癌患者合并胆管结石，而胆管结石中5％～10％将发生胆管癌。肝内胆管结石合并肝内胆管癌往往以胆道结石引发的症状为主要表现，容易导致误诊、漏诊。胆管癌的分子生物学机制目前尚未明了，肝内胆管结石的致病作用不容忽视。
　　 1.核因子KB( Nuclear factor kappaB，NF- KB)普遍存在于细胞浆中，是一组重要的多功能转录因子。由于其发挥的功能广泛，对它的研究已成为当今热点。一般情况下NF- kB与其抑制蛋白I- kB结合以失活的三聚体形式存在于细胞胞浆中，只有脱离I-kB，NF-kB才能处于激活状态。解除抑制的NF-kB因其细胞核定位信号(Nuclear localization signal，NLS)的暴露被迅速介导进入细胞核，与细胞核DNA相应的KB位点发生特异性结合，并在转录起始过程中，参与mRNA的合成，实现对相关基因表达的调控。
　　 已知NF-kB可被应激状态、神经毒素、病毒及病毒蛋白、细菌及其产物LPS、各种细胞因子、创伤及紫外线等理化因素激活，以正反馈或负反馈机制参与炎症反应、免疫应答以及细胞凋亡与细胞增殖的调节，在病理生理变化过程中起关键性作用。动物实验表明，NF-kB活性增高是肝癌早期事件。
　　 2.表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种多功能跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶( tyrosine protein kinase，TPK)生物活性。EGFR与其配体(如TGF-α、EGF)结合后，TPK便被活化。活化的TPK通过两条途径激活细胞信号传递系统，即Ras→RafM→APK途径，通过c-jun、c-fos将信号传递到细胞核内激活AP-1,与细胞增殖激活有关；及PI3K→PKC→IKK途径，使IKBa磷酸化，激活NF- KB细胞外信号最终传递至细胞核内，与细胞的侵袭能力有关。研究发现EGF作为多数肿瘤的生长调节因子可以激活NF-lB信号通路，EGFR的表达也受NF-kB的调控。
　　 炎症细胞分泌的TNF-α能够上调EGFR表达，在EGFR配体(EGF或TGF-α)作用下，气道杯状细胞数目增加，MUC5AC在基因和蛋白质水平的表达增加。
　　 3.MUC1粘蛋白是一种跨膜蛋白，正常情况下主要表达于多种组织、器官中上皮细胞近管腔或腺腔面，呈顶端表达，极性分布。在其氨基末端含有二个EGF样结构区域，与EGFR配体有很高的同源性，参与细胞生长、分化的调控。当某种粘蛋白基因表达时，在胆管壁同一周径上的上皮细胞中均同等程度地表达其产物。研究表明，刺激MUC1高分泌的信号通路均经由NF- kB路径。
　　 MUC1基因敲除小鼠的研究表明，MUC1对小鼠的生长发育无影响，但在其体内诱导的乳腺肿瘤的生长速度和转移趋势均降低。给MUC1基因敲除小鼠投食成石饲料，发现小鼠对胆固醇的摄取和吸收功能发生障碍，对脂肪酸的摄取却正常。其胆囊黏膜MUC1和MUC5AC的表达显著降低，胆囊内粘蛋白的分泌总量显著减少，胆固醇结晶形成和凝聚明显下降，胆囊胆固醇结石生成率显著降低。
　　 因此，我们推测，机体内外有效刺激因素(如应激状态、感染等)激活NF-k B，NF-kB通过反馈机制调节相关细胞因子的表达，相关细胞因子(如TNF-α)上调EGFR的表达，EGFR与其配体结合后，通过调节粘蛋白的分泌和反作用于NF-kB促进肝内胆管结石和肿瘤的生成。为此，我们应用免疫组织化学染色手段，观察NF-kB、EGFR、MUC1在正常肝内胆管组织、肝内胆管结石、肝胆管细胞癌、肝内胆管结石合并肝内胆管癌的肝内胆管上皮细胞的表达，探讨其在病理生理过程中的作用和临床意义。
　　 研究目的
　　 1.观察并比较NF-kB、EGFR、MUC1在正常肝内胆管组织、肝内胆管结石、肝胆管细胞癌和肝内胆管结石合并肝内胆管癌组织中的表达，分析其内在的意义。
　　 2.探讨NF-k B、EGFR、MUC1在肝内胆管细胞癌组及肝内胆管结石合并肝内胆管癌组的表达与病理组织学分级、肿瘤浸润、淋巴结转移关系。
　　 3.分析NF-k B、EGFR、MUC1表达与肿瘤病人生存的相关性。
　　 材料和方法:
　　 1.1实验标本选取与分组
　　 实验方法
　　 134例标本取自1989年08月至2009年06月期间在中山大学第二附属医院手术切除肝组织标本，均为石蜡包埋。男性71例，女性63例，年龄32岁～77岁，平均年龄58.8±10.7岁。所有病例在术前均没有接受放、化疗及抗炎治疗。肝内胆管结石合并肝内胆管癌33例，平均年龄58.1±7.9岁；胆管细胞癌型肝癌44例，平均年龄59.1±10.5岁；肝内胆管结石32例，平均年龄55.5±9.3岁，为实验组；三组间年龄比较，F=1.398，P=0.252,差异无统计学意义。正常的肝内胆管组织25例为对照组，取自肝细胞型肝癌瘤旁2～3cm正常肝组织，均在光学显微镜下证实无炎症、结石、纤维化、不典型增生、癌变等病理改变。
　　 1.2标本处理
　　 标本经冷生理盐水漂洗5min后，10％中性福尔马林溶液固定24小时以上，脱水，然后常规石蜡包埋。将石蜡包埋组织块在切片机上制成3～5μm厚的切片，进行苏木素一伊红(HE)染色及常规病理组织学检查。
　　 1.3免疫组化染色
　　 石蜡切片常规脱蜡至水。新鲜配制3％ H2O2中室温灭活内源性酶10 min，蒸馏水洗涤3次×3 min。EGFR用胃酶消化，370oC15min：MUC1、NF-kB用0.01M枸橼酸盐缓冲液中行微波抗原修复(解冻档)15 min，冷却至室温，0.1M PBS漂洗3次×3 min。滴加血清封闭液，室温孵育20 min，甩去多余液体。滴加一抗(抗体稀释度均为1：50)，4℃过夜，0.1M PBS漂洗3次×3 min。滴加二抗，37℃孵育45 min，0.1M PBS漂洗3次×3 min。滴加S-P复合物，37℃孵育60 min，0.1M PBS漂洗3次×3 min。DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染。脱水、透明、封片。
　　 1.4 NF-k B表达的观察
　　 在普通光学显微镜20×10倍视野下观察，肝内胆管上皮细胞浆或/及细胞核出现棕黄褐色的均质或颗粒样物质即为阳性。
　　 1.5 EGFR表达的观察
　　 在普通光学显微镜20×10倍视野下观察，肝内胆管上皮细胞浆或/及细胞膜出现棕黄褐色的均质或颗粒样物质即为阳性。
　　 1.6 MUC1表达的观察
　　 在普通光学显微镜20×10倍视野下观察，肝内胆管上皮细胞浆或/及腺管上皮细胞膜靠近腺腔缘出现棕黄褐色的均质或颗粒样物质即为阳性。
　　 结论:
　　 1.NF-k B的激活是肝内胆管结石及肝内胆管细胞癌发生过程的早期事件，其机制可能是机体内外有效刺激因素激活NF-k B，NF-k B的持续活化调控相关细胞因子，促进胆管细胞的癌变。
　　 2.EGFR、MUC1的异常高表达与肝内胆管细胞癌恶性程度有关，且与局部浸润、肿瘤转移和预后有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词中英文对照表

声明

第一章 前言

第二章 材料和方法

第三章 结果

第四章 讨论

第五章 结论

本研究的缺陷及展望

参考文献

致谢