不同浓度血管活性肠肽对新生大鼠原始卵泡体外发育影响的实验研究

摘要

如何充分利用生殖资源保存女性的生育能力，是一个值得研究的重要课题。数以万计的原始卵泡是哺乳动物生殖资源的储备库，而在雌性个体的一生中只有极少部分卵泡发育成熟并排卵，绝大多数卵泡在不同的发育阶段闭锁，如果能够充分利用这部分卵泡，将为我们提供大量宝贵的卵子资源。然而，由于我们对原始卵泡向初级卵泡转化机制的了解甚少，迄今尚未能有效地利用卵巢内大量处于较早发育阶段的卵泡，限制了卵泡体外培养这项技术的开展及临床应用。有学者研究发现，神经营养因子如血管活性肠肽(VIP)能诱导新生大鼠卵巢FSH受体、芳香化酶mRNA和蛋白质的表达，抑制体外培养的大鼠窦前卵泡颗粒细胞的凋亡，促进卵巢类固醇激素的合成，可能在调节非促性腺素依赖的卵泡发育与生长方面发挥着重要作用。
　　 基于目前神经递质VIP对卵泡发育影响的研究进展，我们通过添加含不同浓度VIP的培养基进行新生大鼠卵巢体外培养，组织学、PCNA免疫组化及TUNEL凋亡分析原始卵泡的生长发育情况，探讨不同浓度的VIP对离体原始卵泡生长发育的影响。
　　 材料与方法:
　　 1.动物来源：
　　 雌性SD大鼠购自中山大学药学院实验动物中心，清洁级，出生4天，体重10-15g。
　　 2.实验方法：
　　 取自新生4天大鼠的卵巢，随机分为六组：新鲜组、基础培养组、VIP10-6M组、VIP10-7M组、VIP10-8M组、VIP10-9M组。新鲜组未经培养，直接固定、包埋、切片、染色进行病理学检查；基础培养组以无血清基础培养液(0.1％ BSA、0.1％ALBUMAX、1％ITS-X、0.05mg/ml抗坏血酸、青霉素50U/ml，链霉素50μg/ml)培养；VIP10-6M组、VIP10-7M组、VIP10-8M组、VIP10-9M组分别在上述基础培养液中加入10-6M、10-7M、10-8M、10-9M浓度的VIP后培养。在37℃、5％CO2培养箱中培养14天，每48小时更换培养液一次，每次300μ1。培养结束后做病理切片，行组织形态学检查、PCNA免疫组化和TUNEL凋亡分析。
　　 结果:
　　 1.VIP对体外培养卵巢中早期卵泡生长发育的影响
　　 新鲜组卵巢切片显示，0级卵泡(原始卵泡)在全部卵泡所占的比例为59.72％±1.96％，1级卵泡(早期初级卵泡)23.04％±1.94％，2级卵泡(初级卵泡)7.39％±1.40％，3级卵泡(转化期卵泡)3.6％±1.13％，异常卵泡6.26％±1.64％。
　　 培养后，各培养组不同时期卵泡所占比例与新鲜组比较有统计学差异(P<0.05)，培养过程中原始卵泡的百分比减少，生长卵泡和异常卵泡的百分比增加，且各培养组的1级卵泡(早期初级卵泡)百分比明显高于新鲜组，VIP10-7M组最高，基础培养组最低。4个不同浓度VIP组各时期卵泡所占比例与基础培养组比较有统计学差异(P<0.05)，VIP可增加生长卵泡百分比，减少异常卵泡百分比；其他VIP浓度组与VIP10-7M组比较有统计学差异(P<0.05)，VIP10-6M组和VIP10-9M组的生长卵泡百分比显著低于VIP10-7M组(P<0.05)，VIP10-9M组异常卵泡百分比显著高于VIP10-7M组(P<0.05)。
　　 2.PCNA免疫组织化学染色评估卵泡生长情况
　　 各组卵泡PCNA阳性率：新鲜组为37.39％±2.52％，基础培养组、VIP10-6M组、VIP10-7组、VIP10-8M组和VIP10-9组分别为61.85％±2.72％、67.96％±6.02％、73.99％±4.37％、67.44％±4.68％和67.32％±7.12％。各培养组与新鲜组比较有统计学差异( F=56.85，P<0.001)；不同浓度VIP组与基础培养组比较有统计学差异( F=5.46，P=0.002)；其他VIP浓度组与VIP10-7组比较有统计学差异(F=3.59，P=0.043)，VIP10-7M时卵泡PCNA阳性率最高，VIP10-6M次之，VIP10-8M与VIP10-9最小。
　　 3.VIP对卵泡凋亡的影响
　　 新鲜组极少出现TUNEL阳性染色的原始卵泡和早期初级卵泡，而各培养组TUNEL染色阳性的卵泡广泛存在于各个不同生长时期。
　　 各组卵泡的凋亡指数(AIF)分别为：新鲜组7.98％±2.83％、基础培养组30.78％±6.98％、VIP10-6M组24.48％±2.83％、VIP10-7组21.06％±6.32％、VIP10-8M组26.25％±3.67％和VIP10-9M组27.54％±1.49％。总体方差显示各培养组与新鲜组比较有统计学差异( F=26.81，P<0.001)，且新鲜组最低，培养组中VIP10-7M组最低；各VIP处理组与基础培养组比较有统计学差异( F=4.62，P=0.004)，且VIP10-6M组和VIP10-7M组的卵泡凋亡指数与基础培养组有统计学差异(p<0.05)，其中VIP10-7 M组卵泡凋亡指数最低；各VIP浓度组间有统计学差异( F=3.96，P=0.018)，且VIP10-8M组(p<0.05)和VIP10-9M组(p<0.01)与VIP10-7M组有统计学差异。虽不能说明VIP10-7M组和VIP10-6M组浓度的优劣(P>0.05)，但从卵泡凋亡指数看，VIP10-7M优于VIP10-6M及其他VIP处理组。
　　 结论:
　　 1.新生大鼠完整卵巢体外培养过程中，VIP可以促进新生4天大鼠的原始卵泡向初级卵泡的转化。
　　 2.不同浓度的VIP均可降低卵巢组织卵泡细胞的凋亡，提高卵泡体外存活能力，VIP10-7M较其他浓度更明显地促进卵泡细胞的增殖，降低卵泡细胞的凋亡。

目录

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材料与方法

结果

讨论

结论

本研究的局限性和研究展望

参考文献

附图

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