红花黄色素对鸡趾屈肌腱损伤修复影响的实验证实

摘要

目的：
　　 肌腱损伤是手外科学多发性外伤，肌腱修复术后常常形成限制性粘连，严重影响手部功能的恢复，迄今为止尚无一种完全行之有效的防治措施。病理学研究显示肌腱及其周围相关组织均参与此损伤修复过程；即所谓内源性愈合和外源性愈合。本实验研究借助Leghorn鸡屈趾肌腱损伤修复模型、体视学观察、生物力学检测、病灶区碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)，和Ⅰ型胶原蛋白免疫组化探察等方法，研究证实肌腱损伤修复过程中局部病理学变化及其变化规律；局部炎症反应、BFGF和Ⅰ型胶原蛋白对肌腱损伤修复的影响；红花黄色素在病灶区炎症反应、BFGF和Ⅰ型胶原蛋白的表达以及肌腱愈合过程中的作用。以此探讨红花黄色素在肌腱损伤后修复过程中的临床作用及其作用机制。
　　 方法和材料：
　　 1.实验对象：
　　 选用同批孵出、在相同自然条件下喂养的3月龄的健康雄性白色Leghorn鸡56只，体重1.1～1.3kg(平均1.23±0.068kg)。假手术组双侧鸡爪第3趾切开皮肤后逐层进入暴露趾深屈肌腱，但不对肌腱做任何处理，然后逐层缝合。实验组所有Leghorn鸡制备双侧鸡爪第3趾趾深屈肌腱横断后修复模型，方法和标准见[2]。
　　 2.实验方法
　　 (1)模型构建：对双侧鸡爪第3趾趾深屈肌腱手术横断，之后再行外科缝合，术后使用石膏固定使其呈拳击手套状，实验动物随后回笼饲养，并使其能够自由活动。术后3天以含土霉素鸡饲料喂养，旨在预防感染。
　　 (2)体视学和组织病理学检测：分别于术后1、2、4、6周进行取材，期间行体视学观察；包括大体观察鸡趾深屈肌腱吻合口肉芽组织增生情况、肌腱愈合情况和肌腱周围粘连的情况，并对肌腱与周围组织粘连进行评级，以评估其粘连程度，方法及标准见[3]。组织学探察；HE染色之后在光镜下观察肌腱细胞爬行、细胞形态、炎性细胞浸润、胶原纤维生成及排列情况。
　　 (3)生物力学检测：将不同修复时间组的样本(肌腱)由近端至止点从腱鞘内小心锐性游离出来，然后固定于生物力学检测仪上进行抗张力测试，详尽方法、技术和原理见[2]。
　　 (4)免疫组化检测：本实验主要采用免疫组织化学PAP方法；即将Rabbit anti-chicken collagen-Ⅰ和Mouse anti-bFGF抗体在4℃孵育48～72小时；然后分别进行抗兔和抗小鼠IgG(1∶100)室温孵育2小时；最后分别进行兔-PAP和小鼠-PAP(1∶200)室温孵育2小时；DAB-H2O2显色。
　　 (5)数据收集和统计学处理
　　 肌腱粘连程度的评估按照汤锦波[2]论文粘连分度法，而且对于所得数据专门使用Mann Whitney U检验(两组)和H检验(多组)。但组织化学(HE)和免疫组化染色的阳性结构则是借助于IPPS15.0图像分析系统在光镜高倍视野(×400)下获得实验数据(用均数±标准差表示)，并对所获得数据使用SPSS10.0 for windows统计软件包进行统计学处理，它们两组间比较使用t检验，以P＜0.05作为具有统计学意义，多组间比较则使用方差分析ANOVA检验，P＜0.05表明具有统计学差异。
　　 实验结果：
　　 (1)病灶区组织病理学变化
　　 观察显示正常组肌腱完整光滑、腱鞘内可见淡黄色滑液、肌腱与腱周组织无粘连、肌腱滑动性良好。在假手术组呈现轻度的粘连，但易分离，而且肌腱滑动性能基本良好。
　　 实验组肉眼观察显示，在术后1周组病灶区肌腱愈合处及其周围组织存在明显的水肿、粘连、肉芽组织增生。上述变化在术后2周组虽然水肿稍有减轻，但肉芽组织增生加重，周围组织的粘连情况显示其形成于术后1周，并于损伤2周时加重。术后4-6周，病灶区水肿减退、肉芽组织疤痕化、但粘连程度变化不明显。对所获得的实验数据的统计结果显示损伤1周时间组肌腱粘连程度明显低于2-6周时间组(P＜0.05)，但在损伤2-6时间组之间无统计学差异(P＞0.05)之间。组化染色(HE)显示在吻合口处存在大量炎性细胞浸润或聚集，其数量与损伤修复时间和病灶区病理学变化基本一致；即在损伤1-2周时间组，炎性细胞的数量最多，随后其数量逐渐减少。
　　 (2)损伤肌腱修复的抗张力强度变化及其规律
　　 实验设计以生物力学原理检测损伤肌腱修复过程中的抗张力强度变化。所获得的实验数据显示实验组与对照组之间抗张力强度具有统计学意义(P＜0.01)。但不同时间的实验组之间的抗张力强度从术后1-6周，显示逐渐增强趋势，术后6周抗张力强度达到最高，与其它实验组相比具有明显的统计学差异(P＜0.01)，但仍未恢复到正常水平，与正常之间仍有统计学意义(P＜0.01)。
　　 (3)肌腱细胞在肌腱损伤修复过程中的形态学变化
　　 肌腱细胞包括成纤维细胞和腱细胞两类，两者在不同病理和机能状态显示不同的形态，并相互转换。正常肌腱组织的组织化学(HE)染色显示成纤维细胞核呈梭形，细胞呈纤维状排列整齐，密度适中。而腱细胞核染色较深呈圆块状，胞体为不规则形或卵圆形。在肌腱损伤的各实验组，两者在组化染色中难以区分。所以，在此文我们统称为肌腱细胞。
　　 光镜观察显示肌腱细胞在病灶区其核和胞质染色加深、体积增大，表现为增生肥大样外观。肌腱细胞的计数资料显示，肌腱细胞在损伤1周其数量开始增加，到2周时达到高峰，之后逐渐下降，统计结果显示肌腱细胞数量的变化在各实验组之间比较具有显著差异(P＜0.01)。与对照组比较结果显示，在损伤1-4周实验组均具有统计学意义(P＜0.01)，但在损伤6周组肌腱细胞数量接近对照组(P＞0.05)。
　　 (4)病灶区BFGF和Ⅰ型胶原蛋白表达的变化
　　 BFGF在肌腱组织主要表达于损伤组织中的成纤维细胞、腱细胞和局部炎症细胞。我们的免疫组织化学探察显示，正常肌腱弱表达BFGF。在肌腱损伤修复实验组，光镜观察显示阳性细胞呈现多形性外观，定量资料显示其数量与损伤修复时间具有相关性；在损伤1周时间组阳性细胞的数量开始增加，并明显多于对照组(P＜0.01)，持续到损伤修复6周，其数量仍然显著多于对照组(P＜0.01)。对不同损伤修复时间组间比较结果显示，在损伤2周时间组BFGF阳性细胞数量增加最明显(P＜0.01)。进一步按照损伤肌腱不同区域的探察显示，BFGF阳性细胞在吻合口处的数量在各损伤修复时间组均多于远离区域(P＜0.01)。
　　 Ⅰ型胶原阳性蛋白广泛存在于肌腱组织的腱纤维和腱细胞之间的基质内。免疫组化探察结果显示，在正常肌腱组织明显可见阳性结构呈纤维状位于腱纤维之间。定量资料显示，在肌腱损伤各时间组的Ⅰ型胶原阳性蛋白的表达明显高于正常对照组(P＜0.05)。对不同损伤修复时间组间比较结果显示，Ⅰ型胶原阳性蛋白高表达于损伤之后1周，到第2周时其表达量达到高峰，随后逐渐下降，到达损伤修复6周时仍高于正常水平(P＜0.05)。
　　 (5)红花黄色素治疗对肌腱损伤修复的影响
　　 *对病灶区组织病理学变化的影响；通过大体观察、组化染色结果显示在不同的损伤修复时间组，红花黄色素明显抑制病灶区组织水肿、粘连程度、和炎症细胞的浸润或聚集(P＜0.05)。但红花黄色素用药组在各时间组中肌腱细胞的数量明显多于非用药组，两者之间比较具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 *对肌腱抗张力强度的影响：生物力学检测结果显示红花黄色素用药组在不同的损伤修复时间组与非用药组之间比较，用药组肌腱抗张力强度明显高于非用药组(P＜0.01)。
　　 *对病灶区BFGF和Ⅰ型胶原蛋白表达的影响：细胞计数统计结果显示红花黄色素用药组BFGF阳性细胞数目在损伤修复各时间组均明显高于非用药组(P＜0.01)。Ⅰ型胶原蛋白定量资料显示红花黄色素用药组Ⅰ型胶原蛋白的表达量在各损伤修复时间组均明显高于非用药组(P＜0.01)。
　　 结论：
　　 (1)肌腱损伤修复过程中，局部病理变化显示明显的时间依赖性
　　 实验结果证实病灶及其周围区的炎症细胞聚集、水肿和组织细胞的结构变化均发生于肌腱损伤之后1周，到达2周时其反应和变化达到高峰，随着损伤修复时间的延长，其反应和变化逐渐减弱和下降。实验结果同时证实，病灶区组织的粘连程度则与肌腱损伤修复时间成正相关系；即随着损伤修复时间的延长，其粘连程度逐渐加重。
　　 (2)BFGF和Ⅰ型胶原蛋白表达对损伤肌腱的修复具有促进作用
　　 实验结果证实病灶区的BFGF和Ⅰ型胶原蛋白的高表达变化均发生于肌腱损伤之后1周，到达2周时其反应和变化达到高峰，与此同时病灶及其周围区的炎症细胞聚集、水肿和组织细胞的结构变化最为严重。在BFGF和Ⅰ型胶原蛋白随着损伤修复时间的延长逐渐减弱和下降的同时，病灶区组织病理学变化则逐渐减轻，而损伤肌腱的抗张力强度则逐渐增强。提示病灶区BFGF和Ⅰ型胶原蛋白的表达密切牵涉到损伤肌腱的修复过程，对其修复具有促进作用。
　　 (3)红花黄色素促进BFGF和Ⅰ型胶原蛋白的表达及其损伤肌腱的修复过程
　　 实验结果证实病灶区组织病理学变化、BFGF和Ⅰ型胶原蛋白的表达、损伤肌腱的抗张力强度变化均随损伤修复时间而不同。但各不同时间组，红花黄色素用药组与非用药组之间上述变化均具有统计学意义，特别是红花黄色素明显促进损伤肌腱BFGF和Ⅰ型胶原蛋白的高表达，与此同时病灶区组织病理学变化和粘连程度明显减轻、而损伤肌腱的抗张力强度则逐渐增加。结果明显提示红花黄色素的局部使用通过促进病灶区BFGF和Ⅰ型胶原蛋白的高表达来减轻局部炎症反应、减轻组织粘连，从而促进损伤肌腱的修复过程。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一章 前言

1.1肌腱的结构与营养

1.2肌腱损伤修复的机制及其影响因素

1.3肌腱损伤修复领域目前的实验研究及临床治疗现况

1.4相关蛋白的表达与肌腱损伤修复

1.5红花黄色素的药理特性及其作用

1.6本实验研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2.1.实验对象和主要仪器

2.2实验方法

2.3数据收集和统计学处理

第三章 结果

3.1肌腱病灶区病理学变化的体视学观察

3.2肌腱损伤修复过程中的组织病理学变化的形态学特征

3.3肌腱损伤修复过程中抗张力强度的变化

3.4形态学证实BFGF与肌腱损伤修复的关系

3.5肌腱损伤修复过程中I型胶原蛋白表达的变化

3.6红花黄色素对肌腱损伤修复影响的实验证实

第四章 讨论

4.1肌腱损伤与修复

4.2相关蛋白的表达与肌腱损伤和修复

4.3红花黄色素在肌腱损伤和修复过程中的应用、作用及其机制

第五章 结论

5.1肌腱损伤修复过程中，局部病理变化显示明显的时间依赖性

5.2 BFGF和Ⅰ型胶原蛋白表达对损伤肌腱的修复具有促进作用

5.3红花黄色素促进BFGF和Ⅰ型胶原蛋白的表达及其损伤肌腱的修复过程

参考文献

致谢

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