沉默FAK基因表达对人肝癌细胞株HCC-LM3增殖、迁移、凋亡的影响

摘要

原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的发病率在我国居恶性肿瘤发病率的第二位。全国每年新增肝癌病人13万余例，占全世界每年新增病人的40％～50％。以外科切除为主的综合治疗是目前最有效的治疗方法，但中晚期肝癌往往因多种原因影响治疗效果，如肿瘤转移、肿瘤过大或侵犯血管等。目前尚缺乏有效的手段应对肝癌术后高复发，高转移率。研究肝癌侵袭、转移的机制有助于寻找新的治疗策略，而这已成为当前肝癌研究的重点。肿瘤细胞在整合素介导下与细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)粘附是肿瘤细胞侵袭、转移的重要原因之一，在整合素介导的信号转导中粘着斑激酶(Focal Adhesion Kinase，FAK)起关键作用。FAK是一种非受体酪氨酸激酶，它在细胞间及细胞与细胞外基质粘附中起关键作用。研究证明，FAK在乳腺癌、宫颈癌、直肠癌、甲状腺癌、前列腺癌、喉癌、舌癌、肺癌中表达量增高，高表达FAK通常与差的病理分型和预后相联系，并且已经在一些实体肿瘤如乳腺癌中探索了其活化机制以及其通过下游信号传导通路参与细胞周期调控、粘附、侵袭、转移等的作用方式。但是对于肝癌中FAK介导肿瘤细胞生物学活性的相关研究甚少，目前尚不清楚FAK在肝癌细胞侵袭、转移、增值、生存、凋亡过程中所处地位。本课题拟以肝癌细胞株为研究对象，构建质粒转染并筛选出稳定低表达FAK的细胞株，初步探讨下调FAK表达对肝癌细胞迁移和增殖产生的影响，以及为今后对其分子机制研究打下基础。
　　 目的：应用RNA干扰技术，构建针对人粘着斑激酶FAK的shRNA表达载体，研究沉默FAK的表达对人类肝癌细胞LM3增殖、迁移能否产生影响。
　　 方法：根据GenBank数据库提供的FAK基因序列(GI:439874)构建FAK基因shRNA的重组质粒FAK-pSuper-shRNA。经测序鉴定后，在脂质体的介导下转染入包装病毒细胞PHOENIX，优化筛选条件，以1ug/ml嘌呤霉素筛选3～4周获得阳性克隆，以病毒包装细胞上清滤液感染LM3细胞株，1ug/ml嘌呤霉素的完全培养基筛选培养，40d左右获得不同抑制率的阳性克隆，选取抑制率最高稳定表达细胞株命名为LM3-pSuper-FAK。通过Western blot检测抑制效率并应用划痕实验、流式细胞术、MTT实验比较LM3-pSuper-FAK组与对照组迁移、凋亡及增殖的区别。
　　 结果：
　　 (1)成功构建重组质粒FAK-pSuper-shRNA并经测序鉴定基因序列正确。
　　 (2)筛选最佳浓度，实验显示1ug/ml嘌呤霉素筛选时为细胞最小致死浓度。
　　 (3)Western blot：转染重组质粒FAK-pSuper-shRNA后能使肝癌细胞LM3的FAK蛋白的表达下调。根据筛选的不同阳性克隆可有不同的抑制率。其中抑制率最高的克隆下调FAK表达为59.65％。
　　 (4)细胞划痕试验显示下调FAK明显抑制细胞迁移能力。
　　 (5)流式细胞仪测定细胞周期及凋亡：下调FAK表达后LM3细胞细胞增殖指数为36.9％，对照组为61.1％，差别有统计学意义(p＜0.05)；且细胞多被阻滞在G0/G1期，S期明显减少。下调FAK表达后细胞凋亡百分比为6.00％，而对照组为0.88％，差别有统计学意义(p＜0.05)。
　　 (6)MTT：下调FAK表达后细胞增殖抑制率为27.97％，对照组为5.45％，差别有统计学意义(p＜0.05)。
　　 结论：重组质粒FAK-pSuper-shRNA被构建并成功筛选出高抑制率的稳定表达细胞株，降低细胞增殖、迁移能力，为后续研究以及肝癌的基因治疗奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

前言

第一章 FAK-shRNA真核表达载体的构建及稳定表达细胞株的筛选

1材料与方法

2结果

第二章 沉默FAK基因对肝癌细胞生物学特性的影响

1材料与方法

2结果

讨论

结论

参考文献

文献综述：FAK的特性及其与肿瘤的关系

致谢