兔椎间盘退变模型构建及磁性标记ADSC椎间盘内移植的影像学和病理学初步研究

摘要

研究背景:
　　 由椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration，IDD)引起的下腰痛是人类面临的重大健康问题之一，下腰痛给患者和社会带来了沉重的负担，目前临床还没有有效的治疗手段。干细胞移植治疗IDD有着广阔的应用前景，将会为临床治疗IDD所引起的下腰痛提供一种新的治疗手段，给IDD所引起下腰痛的病人带来福音。MRI(Magnetic resonance iamging)具有良好的空间分辨率和时间分辨率，能同时获得解剖及生理信息，可对移植的磁性标记干细胞进行无创、重复的活体、实时、动态监测。
　　 研究目的:
　　 1.探讨X线透视引导兔椎间盘穿刺诱导兔椎间盘退变的发生、发展规律及其病理学改变，以及椎间盘穿刺法构建兔IDD模型的可行性和可靠性。
　　 2.探讨Gd-DTPA、SPIO标记ADSC椎间盘内移植对退变椎间盘的修复作用。
　　 3.MRI活体监测Gd-ADSC、SPIO-ADSC在退变椎间盘内存活、迁移和转归，为临床干细胞移植治疗IDD提供理论基础和活体示踪、监测方法。
　　 材料与方法:
　　 1.兔腰椎IDD模型的制作：
　　 18G穿刺针透视引导下穿刺兔腰椎椎间盘，制作IDD模型，模型制作前、制作后3天(0.5周)、1周、2周、3周、4周、5周、8周、10周行MRI扫描，观察穿刺后椎间盘的退变过程，并在各时间点取病理行组织学检查。
　　 2.兔ADSC的原代培养与鉴定：
　　 采用贴壁法对兔ADSC进行分离、培养。对培养的细胞进行CD44、CD90、CD34、CD45等表面抗原鉴定。
　　 3.兔ADSC的体外标记及检测：
　　 用BrdU、Gd及SPIO对ADSC进行标记，用免疫荧光、MRI扫描、普鲁士蓝染色检测标记的可行性，标记后行台盼蓝拒染试验检测标记细胞的存活率。
　　 4.兔ADSC的移植及MRI活体示踪：
　　 取IDD模型制作后2周的兔子，手术暴露L2/3、L3/4、L4/5椎间盘，用微量注射器分别注射25μLPBS、重悬于25μLPBS的BrdU-ADSC(含106个细胞)及重悬于25μLPBS的BrdU+Gd-ADSC或BrdU+SPIO-ADSC(含106个细胞)。ADSC移植前、移植后即刻、3天、1周、2周、3周、4周、6周、8周(分别对应于模型制作后2周、2.1周、2.5周、3周、4周、5周、6周、8周、10周)进行X光照片及MRI扫描。
　　 5.病理学检查：在MRI扫描各时间点取组织行病理学检查。
　　 6.统计学分析：使用SPSS16.0统计软件，P＜0.05认为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.ADSC体外标记及检测：
　　 ADSCBrdU标记后，免疫荧光染色细胞核可见绿色荧光；SPIO标记后，普鲁士蓝染色细胞浆内可见较多蓝染的铁颗粒，标记的细胞T2WI信号强度及T2值明显减低；Gd标记后，细胞T1WI上信号明显增高，T1值减低。标记细胞与未标记细胞台盼蓝拒染率差异无统计学意义。
　　 2.IDD模型：
　　 透视引导下，穿刺针可准确无误穿刺至椎间盘中心。随着时间的推移，18G针穿刺的椎间盘逐渐退变，T2WI信号强度逐渐减低，穿刺后2周椎间盘退变迅速，2周后已基本稳定，退变缓慢。退变椎间盘T2WI信号强度两两比较结果显示，2周椎间盘T2WI信号强度与1周比较有统计学差异，与3周比较无统计学差异。
　　 3.ADSC移植后MRI活体示踪：
　　 Gd-ADSC移植后即刻T1WI-SPIR序列上可见椎间盘内高信号，但随着时间的推移，高信号迅速减低。SPIO-ADSC移植后即刻T2WI-FFE序列上可见椎间盘内明显低信号，常规T2WI及T2WI-SPIR序列上亦可显示椎间盘内低信号，移植标记细胞的椎间盘T2值较未移植细胞及移植未标记细胞的椎间盘明显减低，SPIO-ADSC移植至椎间盘后10周，仍可检测到明显的T2WI-FFE低信号存在。
　　 4.ADSC移植后MRI评价：
　　 椎间盘穿刺后0～2周，椎间盘T2WI信号强度迅速减低，模型制作后2周，行移植细胞，SPIO-ADSC组椎间盘自移植后至移植后第8周(即模型制作后10周)，其T2WI信号强度与ADSC组及Gd-ADSC组比较差异均有统计学意义。细胞移植后第1周及第2周(即模型制作后第3周及第4周)，ADSC组及Gd-ADSC组T2WI信号强度与PBS组比较差异有统计学意义。
　　 椎间盘穿刺后0～2周，椎间盘T2弛豫时间迅速减低，SPIO-ADSC组椎间盘自移植后至移植后第8周(即模型制作后10周)，其T2弛豫时间与ADSC组及Gd-ADSC组比较差异均有统计学意义。细胞移植后第3天(即模型制作后第2.5周)，ADSC组及Gd-ADSC组T2弛豫时间与PBS组比较差异有统计学意义。
　　 Gd-ADSC移植至椎间盘后，能通过T1值测量进行监测，移植细胞后MRI扫描，Gd-ADSC组T1值明显减低，Gd-ADSC组椎间盘自移植后至移植后第1周(即模型制作后3周)，其T1弛豫时间与PBS组比较差异有统计学意义。
　　 5.病理学检查：
　　 正常椎间盘纤维环、髓核分界清晰，髓核细胞胞浆淡染，纤维环呈同心圆层状排列，细胞排列整齐，形态基本一致，软骨终板连续。
　　 IDD模型制作后，椎间盘髓核细胞坏死、崩解，失去正常形态，纤维环排列不规整，出现裂隙及断裂，纤维环粘液变性，胶原纤维肿胀、坏死，软骨终板变薄、凹陷、破裂，后期椎间盘明显纤维化，软骨终板多处破裂。
　　 PBS组椎间盘髓核细胞坏死，失去正常形态，纤维环排列不规整，发生粘液变性，胶原纤维肿胀，出现裂隙及断裂，注射PBS后8周后椎间盘明显纤维化，结构紊乱，椎间盘高度明显减低。
　　 ADSC移植组椎间盘与同时间点PBS组比较，退变程度较轻，髓核及纤维环内均可见胞浆丰富的软骨样细胞。
　　 结论:
　　 1.X线透视引导下18G穿刺针穿刺椎间盘可成功制作逐渐退变、重复性好的兔IDD模型。
　　 2.利用BrdU、Gd、SPIO成功标记ADSC后，可通过MRI、普鲁士蓝染色、免疫荧光、免疫组化等多种方法进行检测。
　　 3.Gd-ADSC移植至椎间盘后1周内，可通过MRI进行监测；SPIO-ADSC移植至椎间盘后，MRI可较长时间进行监测(大于8周)。
　　 4.ADSC椎间盘内移植有助于修复退变椎间盘和延缓椎间盘退变。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语对照表

声明

第1章 引言

第2章 研究目的

第3章材料与方法

3.1 实验材料

3.2 实验方法

第4章 结果

4.1 IDD模型制作后X光照片、MRI扫描及T2信号强度测定

4.2 IDD模型制作后椎间盘的病理改变

4.3 ADSC的分离培养及鉴定

4.4 ADSC的标记及体外检测

4.5 ADSC移植后MRI活体示踪

4.6 细胞移植后T2WI信号强度及T2、T1弛豫时间测定

4.7 细胞移植修复的椎间盘病理改变

第5章 讨论

5.1 IDD的动物模型

5.2 ADSC的磁性标记及MRI活体示踪

5.3 ADSC的BrdU标记

5.4 细胞移植修复退变的椎间盘

5.5 本实验的限度及后续研究

第6章 结论

参考文献

附录2在学期间发表的文章及参与的课题

致谢