MAPK信号通路在高糖导致人腹膜间皮细胞PARP-1激活、细胞外基质聚集及转分化的作用

摘要

随着终末期肾病患病人数的增加，肾脏替代治疗成为肾专科医务人员的关注焦点之一。腹膜透析作为肾脏替代治疗的一种，具有以下优点：不需要血管通路、不影响日常工作和学习、能较好的清除中分子物质、能延缓残余肾功能下降的速度等。然而，长期使用含葡萄糖的透析液会导致腹膜纤维化，最终放弃腹膜透析。作为长期腹膜透析患者的常见并发症，腹膜纤维化不仅损害腹膜结构，也可导致许多并发症，是当前研究热点之一。然而，目前腹膜纤维化的发生的具体机制仍不清楚，而且防治的措施也较为限，因此，探讨其发病机制及其相关因素，具有重要的意义。
　　 正常情况下，腹膜是一连续的半透膜，由三层结构构成：一层由扁平状问皮细胞呈连续排列所构成的一道单层结构；另一层为问皮细胞(mesothelial cellMCs)下结缔组织；两者之间又有一层基底膜将两层分隔。腹膜纤维化发生时，首先受累的是腹膜间皮细胞，表现为细胞间隙扩大，微绒毛减少或消失，细胞膜葡萄糖载体增多；成纤维细胞数量增加出现问皮细胞层下纤维化。其次是血管的变化，表现为毛细血管数量增多，且血管基膜增厚。长期腹膜透析的患者，间皮细胞的微绒毛减少、消失，从基底膜脱落至完全消失，最后只剩下裸露的纤维结缔组织。
　　 研究发现，高糖腹膜透析液可导致腹膜间皮细胞肥大。近期研究还发现间皮细胞的肥大是细胞早期衰老的表现，这可能与腹膜的损伤有关。最终使腹膜对感染和纤维化的防御功能受损，导致纤维化和功能进行性丧失。
　　 研究显示：高糖引起活性氧化产物(reactive oxygen species，ROS)可能在腹膜纤维化中起重要的作用。我们既往的研究表明，在人腹膜间皮细胞(humanperitoneal mesothelial cells,HPMCs)高血糖介导的ROS可以使多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]活性增加。研究显示，高糖诱导腹膜间皮细胞PARP-1表达增加；下调PARP-1的表达能部分逆转高糖诱导的腹膜问皮细胞转分化及细胞外基质积聚。而丝裂素原活化蛋白激酶通路可被活性氧化产物而激活。ROS可激活MAPK，又可活化PARP-1。研究表明，PARP-1的活化可以通过细胞DNA损伤或非DNA损伤而介导，并呈细胞损伤程度和时间依赖性。在细胞损伤早期，通过细胞信号传导，PARP-1表达上调；后期，大量ROS损伤DNA，活化PARP-1，进而调节细胞修复损伤、炎症反应、细胞凋亡等。活化PARP-1的依赖DNA损伤与非依赖DNA两种平行方式时有重叠，这对在细胞生理、病理状态下PARP-1的功能调节有重要意义。有研究认为，在细胞受损早期，细胞外信号可通过MAPK信号通路激活PARP-1，参与免疫应答、炎症反应；大量ROS可通过MAPK通路介导PARP-1活化，参与细胞凋亡等。
　　 目前，在高糖刺激下，MAPK信号通路是否参与HPMCs的PARP-1的激活，目前尚不清楚。本研究就以上问题试图初步探讨MAPK信号通路和PARP-1的关系及其激活在腹膜间皮细胞转分化及腹膜纤维化当中的作用。这将为腹膜纤维化的防治开拓新的视野和途径，同时为新药的开发和研制奠定基础。
　　 第一章高糖对HPMCs的MAPK通路及PARP-1的影响
　　 一、目的
　　 探讨人腹膜间皮细胞株HMrSV5在高糖刺激下，三条主要MAPK信号通路的活化情况及PARP-1的蛋白表达情况。
　　 二、材料和方法
　　 无血清培养HMrSV5细胞株16h～24h后，分别用高糖(终浓度138mmol/L葡萄糖)刺激0'、5'、30'、1h、2h、8h、24h，并选择等渗的甘露醇作为对照用。Western Blot分别检测不同时间总的P38MAPK及磷酸化的P38MAPK、总的ERK1/2及磷酸化的ERK1/2、总的JNK及磷酸化的JNK的蛋白表达水平。同时用Western blot检测在不同时间点PARP-1的蛋白表达情况。
　　 三、小结
　　 高糖以时间依赖的方式刺激HPMCs后，磷酸化的P38MAPK及磷酸化的JNK表达增加，磷酸化的ERK1/2增高不明显。同时PARP-1的表达在高糖刺激下也呈时间依赖性增高，24小时已很明显。因此我们选择P38MAPK信号通路的特异抑制剂及JNK信号通路特异抑制剂分别抑制P38MAPK及JNKMAPK，观察抑制其通路后，PARP-1的活性变化及对腹膜间皮细胞外基质聚集及对HPMCs转分化的作用。
　　 第二章 MAPK抑制剂对PARP-1、腹膜间皮细胞外基质聚集及细胞转分化的作用
　　 第一节 P38抑制剂对PARP-1的作用、人腹膜间皮细胞外基质聚集及细胞转分化的作用
　　 一、目的
　　 探讨 P38抑制剂对腹膜间皮细胞外基质聚集及细胞转分化的作用；抑制P38MAPK信号通路后，PARP-1的活性变化。
　　 二、材料和方法
　　 无血清培养HPMCs16h-24h后，分为4各组：①低糖组(5.6mmol/L葡萄糖)；②刺激组(138mmol/L葡萄糖)；③抑制剂组(138mmol/L葡萄糖+SB203580，10umol/L)④DMSO对照组。在24小时收取细胞用Western blot检测PARP-1、FN、PAI-1、E-cadherin及α-SMA的蛋白水平变化。
　　 三、小结
　　 高糖可刺激腹膜间皮细胞外基质聚集及人腹间皮细胞转分化，P38抑制剂可逆转。P38抑制剂也可下调其PARP-1的表达，提示P38MAPK可能能激活PARP-1的表达，并参与腹膜间皮细胞外基质聚集及人腹间皮细胞转分化的过程。
　　 第二节 JNK抑制剂对PARP-1的、人腹膜间皮细胞外基质聚集及细胞转分化的作用
　　 一、目的
　　 探讨 JNK抑制剂对腹膜间皮细胞外基质聚集及细胞转分化的作用；抑制JNK信号通路后，PARP-1的活性变化。
　　 二、材料和方法
　　 无血清培养人腹膜间皮细胞株16h-24h后，分为4各组：①低糖组(5.6mmol/L葡萄糖)；②刺激组(138mmol/L葡萄糖)；③抑制剂组(138mmol/L葡萄糖+SP600125，10umol/L)④DMSO对照组。在24小时收取细胞用Westem blot检测PARP-1、FN、PAI-1、E-cadherin及α-SMA的蛋白水平变化。
　　 三、小结
　　 高糖可刺激腹膜间皮细胞外基质聚集及人腹间皮细胞转分化，JNK抑制剂可逆转，这提示JNK-PARP-1通路也参与腹膜间皮细胞外基质聚集及人腹间皮细胞转分化的过程。
　　 全文总结:高糖可使得人腹膜间皮细胞P38MAPK及JNKMAPK通路的活化，ERK1/2MAPK通路活化不明显。运用P38及JNK的抑制剂，均能使得PARP-1活性下调，同时逆转腹膜间皮细胞外基质聚集及HPMCs转分化。这提示在高糖刺激腹膜间皮细胞时，P38MAPK及JNKMAPK可能能直接激活PARP-1，并参与腹膜间皮细胞外基质聚集及人腹间皮细胞转分化。这还有待于进一步研究证实。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照表

声明

前言

第一章高糖对人腹膜间皮细胞的MAPK通路及PARP-1的影响

一、研究目的

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

五、小结

第二章抑制P38MAPK及JNK信号通路对PARP-1、人腹膜间皮细胞外基质聚集及转分化的作用

第一节P38抑制剂对PARP-1、人腹膜间皮细胞外基质聚集及转分化的作用

一、研究目的

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

五、小结

第二节 JNK通路抑制剂对PARP-1、人腹膜间皮细胞外基质聚集及转分化的作用

一、研究目的

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

五、小结

讨论

全文总结

参考文献

致谢