IL-2和IL-7在调控调节性T细胞和记忆性T细胞的产生和功能中的新作用机制

摘要

第一部分新生小鼠调节性T细胞的“默认”产生机制
　　 目的：CD4+Foxp3+调节性T细胞(Treg)能广谱抑制各种免疫反应。但Treg的产生机制，尤其是在新生小鼠免疫系统发育时的Treg产生机制尚不清楚。本课题拟研究在不同TCR刺激下新生小鼠T细胞转化成Treg的潜力。
　　 方法：从新生或成年Foxp3/GFP小鼠胸腺或脾脏中分选CD4+Foxp3-T细胞，予不同的TCR刺激，3天后流式细胞仪检测Foxp3/GFP阳性细胞比例。为鉴定新生小鼠Treg，予CD3/CD28单抗刺激新生小鼠CD4+Foxp3-T细胞3天后应用流式细胞分选仪分选Foxp3/GFP阳性细胞(新生小鼠Treg)，并用流式细胞仪检测新生小鼠Treg的表型和TCR再刺激时Foxp3表达的稳定性。应用3H-胸腺嘧啶摄入法检测新生小鼠Treg的体外抑制功能。体内实验部分，将CD3单抗腹腔注射入新生或成年小鼠体内，或将新生或成年小鼠CD4+Foxp3-T细胞过继输注入Rag1-/-小鼠体内，用流式细胞仪检测Treg的产生。
　　 结果：在不同方式的TCR刺激下，在不添加外源性TGF-β和IL-2条件下，高达70％新生小鼠CD4+Foxp3-T细胞转化成CD4+Foxp3+Treg，而在相同条件下，成年小鼠Treg转化率低于10％。这些新生小鼠Treg具有抑制功能并相对稳定地表达Foxp3。更重要的是，新生小鼠这种“默认”转化成Treg的能力在出生后2周逐渐消失。与体外发现相符，腹腔注射CD3单抗刺激T细胞能使新生小鼠Treg增加3倍，而不能显著增加成年小鼠Treg数量。将新生或成年小鼠Foxp3-T细胞过继输注入Rag1-/-小鼠，12天后新生小鼠T细胞的体内Treg转化率是成年小鼠的6倍。而令人意外的是，IL-7限制了体外新生小鼠Treg的产生。
　　 结论：综上，在TCR刺激时，新生小鼠T细胞在无外源性IL-2和TGF-β条件下，内在地“默认”分化成Treg，而IL-7则可能限制了这种“默认”产生机制。
　　 第二部分IL-2信号通路限制获得性调节性T细胞前体细胞的形成但诱导其Foxp3的表达
　　 目的：胸腺来源的天然调节性T细胞(nTreg)产生的“两步模型”概念已被接受。本研究将探讨外周是否也存在获得性调节性T细胞(iTreg)前体细胞，以及IL-2在形成这些前体细胞和诱导其Foxp3表达的作用。
　　 方法：为确定外周iTreg前体细胞的存在，分离、提纯外周CD4+CD25+Foxp3-细胞，并予不同的细胞因子刺激，3天后用流式细胞仪测定Foxp3表达。建立“两步”培养法研究影响iTreg前体细胞产生的因素。在“两步”中的“程序化”阶段，予不同细胞因子、中和抗体或通路阻断剂处理培养细胞。“程序化”处理3天后，在IL-2刺激下继续培养3天(“Foxp3诱导”阶段)，流式细胞仪检测6天培养细胞的Foxp3表达。分选6天培养细胞中的Foxp3/GFP+细胞，流式细胞仪检测该群细胞的表型和再刺激时Foxp3表达的稳定性，体外和体内抑制功能分别通过3H-胸腺嘧啶摄入法和易激性肠炎模型进行评估。
　　 结果：IL-2刺激CD4+CD25+Foxp3-脾脏细胞能产生超过10％Foxp3+iTreg，而其他γc依赖性细胞因子没有类似效果。在CD4+T细胞接受TCR刺激的“程序化”阶段，抑制IL-2-Jak3-Stat5信号通路能产生包含iTreg前体细胞的CD4+CD25+Foxp3-T细胞。而在“Foxp3诱导”阶段，IL-2是诱导iTreg前体细胞表达Foxp3的最强细胞因子。在6天培养细胞中，30-40％T细胞表达Foxp3，产生iTreg的数量是初始培养细胞的5倍以上。尽管在此模型中iTreg的产生不需要加入外源性的TGF-β，阻断TGF-β信号通路显著减少iTreg的产生。口两步模型口产生的iTreg在TCR再刺激时能稳定表达Foxp3，并能在Rag1-/-小鼠中预防由CD4+CD45RBhighT细胞介导的易激性肠炎的产生。
　　 结论：IL-2-Jak3-Stat5信号通路负性调控iTreg前体细胞的产生，但正性调控这些前体细胞表达Foxp3。
　　 第三部分 IL-2夺获和TGF-β在CD4+CD25+调节性T细胞抑制CD4+CD25-T细胞活化中的协同作用
　　 目的：关于Treg抑制功能机制目前已有多种观点，但这些机制间的相互作用尚未明确。本研究旨在探讨其中两个重要机制——IL-2夺获与TGF-β在Treg抑制功能中的相互作用。
　　 方法：在圆底培养板或transwell系统进行的体外抑制试验中，反应细胞(Tconv)接受同基因抗原提呈细胞(APCs)和可溶性CD3单抗刺激，并与Treg共培养，予IL-2中和抗体、TGF-β或TGF-β中和抗体处理细胞。3天后用流式细胞仪检测Tconv的活化、增殖和存活情况。在某些抑制试验中，Tconv来自IL-2-/-小鼠或Bcl-2转基因小鼠。
　　 结果：在体外抑制试验中，组成性表达Bcl-2的Tconv(体外培养中具有抗凋亡特性)并不能逆转Treg的抑制作用。而通过增加钙内流、强化共刺激信号或加入细胞因子等方式增强Tconv的活化能逆转Treg的抑制作用。Treg不能抑制已活化的Tconv，而能抑制幼稚性T细胞活化标记性分子的表达，提示Treg是通过抑制Tconv的早期活化介导其抑制功能的。有趣的是，IL-2夺获和TGF-β，这两个Treg抑制机制，单独作用并不能有效抑制Tconv的活化和增殖。而两者联合作用能产生类似于Treg的抑制功能。Transwell系统显示两者均参与了Treg的抑制功能。
　　 结论：Treg的两个抑制机制—IL-2夺获和TGF-β联合作用可能在有效抑制Tconv早期活化中发挥协同作用。
　　 第四部分 IL-7在活化期促进记忆性CD4+T细胞的产生
　　 目的：在T细胞活化期多个活化(抗原，共刺激分子和细胞因子)信号均影响后续记忆性T细胞(Tm)的产生。而IL-7受体不仅高表达于Tm，同时也高表达于幼稚性T细胞(Tn)，本研究将探讨在Tn活化期IL-7刺激能否促进其存活并增加Tm的产生。
　　 方法：予负载OVA323-339抗原肽的抗原提呈细胞(APCs)刺激OT-Ⅱ转基因CD4+T细胞。在培养的最初两天，IL-7或IL-7样细胞因子TSLP添加到细胞培养中。6天后检测培养细胞的活化、增殖和存活情况，并通过过继输注入B6-SJL小鼠以监测Tm的产生。
　　 结果：在T细胞活化早期，IL-7或TSLP刺激并不显著影响6天培养的CD4+T细胞的活化、增殖和葡萄糖摄入。然而，IL-7能显著减少凋亡细胞的比例。过继输注6天培养的OT-ⅡT细胞入B6-SJL小鼠(CD45.1+)显示活化期予IL-7处理能分别在受体脾脏和淋巴结中增加3倍(p＜o.05)和4倍(P＜0.05)输注细胞的恢复。几乎所有过继输注的CD4+T细胞均获得效应型(CD44+CD62L-)或中央型(CD44+CD62L+)Tm表型。
　　 结论：T细胞活化期IL-7处理能增加CD4+Tm的产生，而TSLP并没有类似作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

全文前言

第一部分新生小鼠调节性T细胞的“默认”产生机制

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分IL-2信号通路限制获得性调节性T细胞前体细胞的形成但诱导其Foxp3的表达

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分IL-2夺获和TGF-β在CD4+CD25+调节性T细胞抑制CD4+CD25-T细胞活化中发挥协同作用

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分IL-7在T细胞活化期促进记忆性CD4+T细胞的产生

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

展望

致谢

附录