细胞转化模型在化学致癌物筛查中的应用研究

摘要

随着科学技术的发展，越来越多的化学致癌物进入人类的生活和生产领域，其中很多具有潜在致癌性。目前的人类化学致癌物检测手段由于自身局限性，远不能满足人类可疑化学致癌物检测日益增长的需要，这促使人们寻找快速有效的检测方法。
　　 细胞转化实验是一种化学致癌活性的短期检测模型，能检测遗传毒性和非遗传毒性化学致癌物，日益受到人们的关注。本课题组已证实，癌基因高表达人永生化细胞模型如高表达H-RasV12和c-Myc的永生化人支气管上皮细胞(human bronchial epithelialcell，HBE)具有灵敏度好、能缩短细胞转化间期和检测各种类型的化学致癌物等优点，是一种具有应用前景的化学致癌物检测手段。
　　 体内外研究表明，细胞恶性转化是一个多阶段、涉及多基因突变的过程。癌基因高表达通过加速基因突变频率促进细胞恶性转化。DNA修复缺陷能加快细胞基因突变，理论上也能象癌基因高表达一样促进细胞恶性转化。许多临床资料表明DNA修复缺陷是肿瘤的重要易感因素之一。核酸切除修复机制中关键基因如ERCC1(excision repaircross-completion gene1)和ERCC2(excision repair cross-completion gene2)、DNA双链断裂修复机制中关键基因如ATM(ataxia-telangiectasia mutated gene)和错配修复机制中关键基因如MSH2(mutS homolog2)的功能缺失均能引起人类肿瘤早发、多发。动物研究也表明一些DNA修复基因敲除小鼠是良好的化学致癌活性检测模型[1-4]。除此之外，DNA修复缺陷使人上皮细胞对病毒癌基因诱导的细胞转化更加敏感[5，6]。因此，我们推测，人DNA修复缺陷细胞模型有可能运用于化学致癌活性短期检测系统。
　　 本课题选择H-RasV12和c-Myc高表达的人支气管上皮细胞和DNA损伤修复基因缺陷的人支气管上皮细胞，选择人类确证化学致癌物苯并芘[benzopyrene，B(a)P]作用于上述两种类型的细胞株，通过软琼脂克隆形成试验和裸鼠皮下成瘤试验验证不同通路的DNA损伤修复基因缺陷能否促进细胞转化，比较癌基因高表达和DNA损伤修复基因缺陷细胞模型在化学致癌活性检测中的效能，进一步完善人细胞转化模型，为人细胞转化模型的实际应用提供理论依据。
　　 1.研究方法
　　 1.1 DNA损伤修复基因缺陷HBE细胞株的建立
　　 采用慢病毒载体介导的siRNA技术在人支气管上皮细胞的基础上构建DNA损伤修复基因缺陷HBE细胞株HBE-shERCC1、HBE-shERCC2、HBE-shATM和HBE-shMSH2，RT-PCR方法检测各DNA损伤修复基因mRNA的表达。通过形态学观察、生长增殖以及恶性转化试验观察所构建细胞株的生物学特性
　　 1.2.DNA损伤修复基因缺陷HBE细胞株DNA损伤修复能力的检测
　　 通过双核微核实验和彗星实验检测所构建DNA损伤修复缺陷细胞株的DNA损伤修复能力。
　　 1.3 B(a)P诱导细胞转化实验
　　 1.3.1 B(a)P染毒浓度的确定：
　　 采用台盼兰染色法，检测B(a)P对HBE细胞的IC50。选择6.25％IC50、12.5％IC50和25％ICs0作为HBE细胞苯并芘染毒剂量。
　　 1.3.2细胞转化试验
　　 每周染毒一次，连续染毒。染毒后第4周开始每隔两周做一次软琼脂试验；连续两次软琼脂试验出现阳性结果后进行裸鼠皮下成瘤试验。
　　 2.结果
　　 2.1 DNA损伤修复基因缺陷HBE细胞株的建立
　　 RT-PCR法检测结果表明，各DNA损伤修复基因缺陷HBE细胞均构建成功。与HBE-shGFP相比，各DNA修复缺陷细胞在形态上没有明显改变，没有恶性转化表型，但HBE-shATM和HBE-shMSH2细胞株的生长速度减慢。
　　 2.2 DNA损伤修复基因缺陷HBE细胞株DNA损伤修复能力检测
　　 2.2.1双核微核实验结果
　　 双核微核实验结果表明：1.HBE-shGFP、HBE-shERCC1、HBE-shERCC2、HBE-shATM和HBE-shMSH2细胞的NDI值与B(a)P浓度呈负相关关系，存在剂量-效应关系，5μMB(a)P作用24小时，与对照细胞相比，各DNA修复缺陷HBE细胞株NDI值分别降低了16.77％、13.30％、29.26％和16.49％；2.HBE-shGFP、HBE-shERCC1、HBE-shERCC2、HBE-shATM和HBE-shMSH2细胞的双核细胞微核率与B(a)P浓度呈正相关关系，存在剂量-效应关系，5μMB(a)P作用24小时，分别为对照细胞的1.95倍、1.88倍、2.53倍和2.64倍；3.HBE-shGFP、HBE-shERCC1、HBE-shERCC2、HBE-shATM和HBE-shMSH2细胞的核桥双核细胞率与B(a)P浓度呈正相关关系，存在剂量-效应关系，其中只有HBE-shATM和HBE-shMSH2的核桥双核细胞率在各B(a)P各剂量水平均比对照细胞的高，5μMB(a)P作用24小时，分别为对照细胞的2.74倍和2.61倍；4.HBE-shGFP、HBE-shERCC1、HBE-shERCC2、HBE-shATM和HBE-shMSH2细胞的核芽双核细胞率与B(a)P浓度呈正相关关系，存在剂量-效应关系，5μM B(a)P作用24小时，分别为对照细胞的1.47倍、2.38倍、1.50倍和2.44倍。以上结果提示，DNA损伤修复基因缺陷损害了HBE细胞对B(a)P所致遗传损伤的修复能力。
　　 2.2.2彗星实验结果
　　 彗星实验结果表明，HBE-shGFP、HBE-shERCC1、HBE-shERCC2、HBE-shATM和HBE-shMSH2细胞的尾矩(tail moment,TM)与B(a)P浓度呈正相关关系，存在剂量-效应关系，5μMB(a)P作用24小时，分别为对照细胞的1.55倍、1.57倍、1.62倍和1.55倍。以上结果提示，DNA损伤修复基因缺陷损害了HBE细胞对B(a)P所致遗传损伤的修复能力。
　　 2.3细胞转化实验
　　 2.3.1染毒浓度的确定
　　 本课题组前期研究已确定B(a)P对HBE细胞的IC50为80μM，HBE细胞B(a)P染毒浓度为5μM、10μM和20μM。
　　 2.3.2 HBEM和HBER细胞转化实验
　　 HBEV、HBEM和HBER细胞在软琼脂中的平均克隆形成数与B(a)P染毒剂量之间存在剂量-效应和时间-效应关系。在低剂量代谢活化和连续染毒的条件下，20μM B(a)P诱导HBEM和HBER细胞转化的时间分别为第12周和第8周，而HBEV于第14周仍未转化。以上结果提示癌基因高表达明显缩短细胞转化间期，HBER比HBEM更敏感。
　　 2.3.3 DNA修复缺陷HBE细胞转化实验
　　 各DNA损伤修复基因缺陷HBE细胞在B(a)P连续作用20周后，均未能发生转化。这表明以上几种DNA修复缺陷细胞对B(a)P诱导的细胞转化作用不敏感。
　　 3.结论
　　 3.1成功构建了ERCC1、ERCC2、ATM和MSH2等DNA损伤修复基因缺陷HBE细胞株。这些所构建细胞株在生长形态、锚着独立性生长和细胞转化活性等生物学特性方面均未发生明显改变。
　　 3.2 ERCC1、ERCC2、ATM和MSH2等DNA损伤修复基因缺陷HBE细胞对B(a)P诱导的DNA损伤效应敏感性增高。
　　 3.3 ERCC1、ERCC2、ATM和MSH2等DNA修复基因缺陷均不能缩短致癌物诱导的细胞转化间期。在化学致癌活性检测中，癌基因高表达细胞模型比DNA损伤修复基因缺陷细胞模型灵敏。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语词汇表

声明

前言

第一章 材料与方法

第二章 结果

第三章 讨论

结论

参考文献

综述：DNA错配修复系统与肿瘤

附录：硕士期间发表的研究论文、参加的学术会议及参与的课题

致谢