文摘
英文文摘
声明
第一章 前言
1.1天然免疫及炎症反应
1.2 内毒素损伤
1.3 LPS/TLR4信号转导
1.3.1 MyD88依赖通路-NFκΒ途径
1.3.2 MyD88依赖通路-P13K-Akt途径
1.3.3 MyD88依赖通路-MAPK途径
1.3.4 LPS/TLR4的负调控机制
1.4 miRNA与天然免疫
1.4.1 微小RNA
1.4.2 miRNA与TLR信号通路
1.4.3 miRNA与免疫疾病
1.5本论文研究目的和意义
第二章:内毒素所致SIRS小鼠模型的建立
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2主要仪器
2.1.3试剂及配制
2.1.4 引物设计
2.2实验方法
2.2.1动物分组及实验模型制作
2.2.2 总RNA提取
2.2.3 cDNA合成
2.2.4 SYBR real-time PCR
2.2.5冰冻切片的制作
2.2.6苏木素-伊红(HE)染色
2.3 结果
2.3.1 小鼠肝、脾、肺、肾组织病理学检查
2.3.2小鼠肝、脾、肺、肾中TLR4、IL-1β、TNFα的表达
2.4讨论
2.5 小结
第三章:内毒诱导全身系统性炎症反应综合症小鼠脾脏miRNA表达谱分析
3.1 实验材料
3.1.1 主要试剂
3.1.2主要仪器
3.1.3 引物
3.1.4生物软件及网站
3.2实验方法
3.2.1 LPS注射及样品采集
3.2.2芯片实验流程
3.2.3总RNA提取
3.2.4小鼠miRNA芯片检测具体步骤
3.2.5 Real-time PCR验证
3.2.6数据分析
3.3 结果
3.3.1 总RNA质量
3.3.2 miRNA芯片筛选结果
3.3.3实时荧光定量PCR验证芯片结果
3.3.4数据生物学意义分析结果
3.4讨论
3.4.1 miRNA表达谱芯片试验
3.4.2芯片试验数据分析
3.4.3 miRNA表达谱在LPS反应中的变化
3.4.4 miRNA靶基因功能聚类及通路分析
3.5 小结
第四章:miRNA表达、靶基因鉴定及对LPS信号转导相关基因的作用分析
4.1 实验材料
4.1.1细胞及主要试剂
4.1.2 引物、miRNA-mRNA结合位点序列
4.1.3主要仪器
4.2实验方法
4.2.1 RAW264.7、HEK293细胞的复苏与培养
4.2.2TNFα蛋白在LPS刺激的RAW264.7细胞中表达动力学研究
4.2.3酶联免疫检测(ELISA)
4.2.4细胞总RNA提取及RT-PCR
4.2.5转染
4.2.6载体构建
4.2.7双荧光素酶报告基因检测
4.2.8核蛋白抽提
4.2.9外源miRNA mimics对NF-κΒ转录活性的影响
4.2.10 miRNA mimics/inhibitor TNFα mRNA水平的影响
4.2.11 miRNA mimics对靶基因影响
4.2.12蛋白质定量
4.2.13 Western blot
4.3 结果
4.3.1 miRNA组织表达谱
4.3.2TNFα在LPS刺激的RAW264.7细胞中表达动力学
4.3.3 miRNA在LPS刺激的RAW264.7细胞中的表达
4.3.4 miRNA过表达对TNFα、IL-6、IL-1β表达影响
4.3.5 miR-1224对NF-κΒ活性的影响
4.3.6 miR-1224对Spl的调控作用
4.3.7 Sp1挽救试验
4.4讨论
4.5小结
第五章:pre-mir-RNA重组腺病毒载体的构建
5.1 实验材料
5.1.1细胞、质粒和主要试剂
5.1.2主要仪器
5.2实验方法
5.2.1含目的基因重组穿梭质粒的制备
5.2.2含miRNA前体的重组腺病毒毒种制备
5.2.3重组腺病毒的鉴定
5.2.4重组腺病毒大量制备及纯化
5.2.5重组腺病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)测定
5.3结果
5.3.1 mmu-mir-494、mmu-mir-1224腺病毒载体构建
5.3.2携带pre-miRNA重组腺病毒载体制备
5.4讨论
5.5小结
全文总结
参考文献
发表文章
致 谢