日本血吸虫SCP/TAPS蛋白的克隆表达和生物学功能初步研究

摘要

血吸虫病是一种分布广泛，危害严重的人兽共患病。目前，WHO估计全世界有约74个国家和地区流行该病，约2亿人受感染，每年死于血吸虫病的人数达百万之多，血吸虫病至今仍是亟待解决的严重的公共卫生问题。目前，血吸虫病的防治措施主要是在易感地区进行大规模的化疗、灭螺和健康教育。化疗虽然可暂时降低发病率，但不能抑制再感染的发生，也不能阻止感染的传播，况且已经发现某些血吸虫株对化疗药物如吡喹酮产生抗性。为弥补药物治疗的不足，WHO/TDR将血吸虫病疫苗的研究列为优先发展的项目之一而予以重点支持。随着日本血吸虫基因组测序的完成，对其不同发育阶段基因和蛋白表达动态变化的了解，将有助于探索血吸虫生长发育机制，寻找与其生长发育相关的关键的酶、功能蛋白或基因，为研制有效的阻断传播疫苗和新药开发提供科学指导。
　　 在我们通过日本血吸虫EST数据库寻找与生长发育有关的基因时，我们发现一感兴趣的基因家族——SCP/Tpx-1/Ag5/Pr-1/Sc7(SCP/TAPS)蛋白家族。几乎所有真核生物都含有SCP/TAPS蛋白，这些蛋白的共同特点是都具有SCP保守结构域。目前，SCP保守结构域的确切功能还不是很清楚，但研究发现不同生物中SCP/TAPS蛋白发挥着不同的生物学作用，如调节免疫应答、性发育成熟、潜在的疫苗候选分子等。目前，许多吸虫、线虫中都有SCP/TAPS蛋白的研究报道，但对日本血吸虫SCP/TAPS蛋白还没进行详细的分析和研究，因此我们通过生物信息学工具对日本血吸虫这一蛋白家族进行分析，并挑选出感兴趣的蛋白作为进一步研究的对象。
　　 目的：通过NCBI上公共数据库检索出日本血吸虫SCP/TAPS蛋白，序列同源比对、分子进化树分析等生物信息学工具对它们进行详细的分析，找到它们之间的异同点。从中挑选出感兴趣的基因进行深入的研究，初步探讨它们在日本血吸虫生活史的完成过程中所发挥的生物学作用。
　　 方法：
　　 ⑴以黄蜂毒液抗原5为检索源，通过tBLASTx检索日本血吸虫基因组数据库，检索出同源的EST序列。利用生物信息学软件对各序列的结构域、信号肽进行分析，多序列同源比对和分子进化树分析其进化规律，从中挑选出SiSCP1、SjSCP2作为进一步研究的对象。
　　 ⑵根据SjSCP1、SjSCP2的cDNA序列PCR扩增出相应的片段，并克隆到原核表达载体pET-28a(+)中，大肠杆菌中诱导表达，亲和层析纯化目的蛋白。
　　 ⑶RT-PCR检测SjSCP1、SjSCP2在雌虫、雄虫、虫卵和尾蚴各阶段转录水平的不同。rSjSCP1、rSjSCP2免疫小鼠得到特异性抗体，制备各阶段虫体粗抗原，Western-blotting分析SjSCP1、SjSCP2在各阶段蛋白表达水平的不同。
　　 ⑷以rSjSCP1抗血清为一抗，对日本血吸虫感染的兔肝脏石蜡切片以及尾蚴进行SjSCP1的组织学定位分析。
　　 ⑸尾蚴攻击感染BALB/c小鼠，分别于感染前和感染后取血，每周1次，连续12周，ELISA检测小鼠血清中抗原特异性总IgG、IgG1、IgG2a抗体的动态变化。
　　 ⑹rSjSCP1、rSjSCP2特异性抗体对小鼠日本血吸虫感染的影响rSjSCP1、rSjSCP2免疫BALB/c小鼠，每2周一次，共三次，末次免疫后2周经皮肤感染日本血吸虫尾蚴，同时设置PBS对照组。感染后42天处死小鼠，计数成虫回收数、每克肝虫卵数，计算减虫率和减卵率。rSjSCP1另设一组攻击感染后2周再行蛋白免疫，方法同前但只加强免疫一次。取小鼠肝脏石蜡包埋后做病理切片并HE染色，测量单个虫卵肉芽肿直径，观察rSjSCP1、rSjSCP2特异性抗体对虫卵肉芽肿的影响。ELISA检测每次免疫后及攻击感染后2周、4周、6周血清中抗原特异性总IgG、IgG1、IgG2a抗体的动态变化。
　　 ⑺SPSS统计软件对各组数据进行分析处理，采用Student's t检验观察各组数据间有无统计学差异。
　　 结果：
　　 ①以黄蜂毒液抗原5为检索源，通过tBLASTn检索日本血吸虫EST数据库，共搜索出65条EST序列。经过序列比对，排除重复序列，共得到17条Unigene。NCBI保守结构域数据库搜索发现它们均具有SCP保守结构域，除AAW25499具有2个外其它均只有一个。序列同源比对和分子进化树分析发现这些蛋白可以分为3个不同的亚组。经PCR确定后，AAW24529和AAW24579作为进一步的研究对象，并分别命名为SjSCP1、SjSCP2。SjSCP1完整ORF含666bp，编码221个氨基酸，理论分子量为24.34 kDa，理论等电点为9.38，SignalP预测前25个氨基酸为分泌信号肽序列。序列中含有6个N-糖基化位点，5个N-肉豆蔻酰位点，3个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点和1个低密度脂蛋白受体。与曼氏血吸虫SmVAL15氨基酸序列一致性最高，达58％。BepiPred预测SjSCP1中存在12个B细胞线性表位。SjSCP2完整ORF含582bp，编码193个氨基酸，理论分子量为22.28kDa，理论等电点为9.11。序列中含有1个N-糖基化位点，3个N-肉豆蔻酰位点，4个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点和1个的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位点，1个酪氨酸激酶磷酸化位点。与曼氏血吸虫SmVAL12氨基酸序列的一致性最高，可达60％。BepiPred预测SjSCP2内存在7个B细胞线性表位。
　　 ②根据GeneBank中SjSCP1、SjSCP2的ORF序列设计特异性的引物，进而将目的基因片段定向克隆到pET-28a(+)载体中，双酶切和测序证实重组质粒构建成功。重组质粒在大肠杆菌中经IPTG诱导后有表达，表达产物经亲和层析纯化，获得目的蛋白。
　　 ③RT-PCR检测发现SjSCP1只在虫卵、尾蚴阶段有表达。Western blotting发现抗SjSCP1小鼠血清可以识别出可溶性虫卵抗原、虫卵分泌排泄抗原中的一蛋白条带，说明SjSCP1主要由虫卵分泌。但所识别的分子条带大小约35kDa，明显大于SjSCP1的理论预测分子量。免疫荧光发现SjSCP1主要由虫卵内的毛蚴和尾蚴的腺体分泌。RT-PCR检测发现SjSCP2在雌虫、雄虫、虫卵和尾蚴阶段都有表达，抗SjSCP2小鼠血清可识别出可溶性成虫抗原一蛋白条带，分子量与SjSCP2的理论预测分子量大小一致。
　　 ④日本血吸虫感染的BALB/c小鼠体内SjSCP1、SjSCP2特异性抗体分析ELISA检测发现SjSCP1特异性总IgG抗体在小鼠感染日本血吸虫6周后开始升高，并一直维持在这一较高水平。抗体亚类分析发现抗原特异性IgG1抗体水平明显高于IgG2a抗体水平。而SjSCP2特异性总IgG抗体在小鼠感染后一直维持在一较低的水平，直到感染后第9周才有所增加，其中以抗原特异性IgG1抗体升高为主，IgG2a抗体水平与感染前相比无明显变化。
　　 ⑤rSjSCP1、rSjSCP2特异性抗体对小鼠日本血吸虫感染的影响rSjSCP1免疫BALB/c小鼠后，血清中抗原特异性总IgG抗体水平明显升高，抗体亚类分析发现抗原特异性IgG1、IgG2a抗体都升高；小鼠攻击感染后2周再免疫rSjSCP1诱导出的免疫应答也如此，在感染后第4周抗体水平明显升高。rSjSCP2免疫后抗原特异性总IgG抗体升高，抗体亚类分析发现以IgG1升高为主。攻击感染后发现rSjSCP1、rSjSCP2特异性抗体对机体均无免疫保护作用，成虫数和每克肝虫卵数较PBS对照组有所增加。肝脏病理切片发现rSjSCP1免疫感染组单个虫卵肉芽肿大小与对照组无明显差异，但rSjSCP2免疫组单个虫卵肉芽肿面积明显减少，说明rSjSCP2特异性抗体可减轻小鼠肝脏免疫病理损伤，具有调节宿主与血吸虫免疫应答的潜能。
　　 结论：
　　 ⑴生物信息学分析发现日本血吸虫中存在17个SCP/TAPS蛋白，它们可以分为3个亚组。
　　 ⑵SjSCP1在虫卵和尾蚴阶段有表达，并为虫卵分泌排泄抗原的成份之一，主要定位在虫卵内的毛蚴和尾蚴的腺体；SjSCP2在雌虫、雄虫、虫卵和尾蚴阶段都有表达。
　　 ⑶小鼠感染后6周，SjSCP1特异性抗体水平开始升高并一直维持在这一较高水平，其中以抗原特异性IgG1升高为主；而日本血吸虫感染小鼠体内SjSCP2特异性抗体水平一直维持在一较低水平。
　　 ⑷rSjSCP1、rSjSCP2免疫后均能诱导小鼠产生高滴度的抗体，但对小鼠均不能产生保护性的免疫；rSjSCP2特异性抗体可明显减轻小鼠肝脏免疫病理损伤，具有调节宿主与血吸虫免疫应答的潜能。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩写词

声明

前 言

第一章日本血吸虫（中国大陆株）SCP/TAPS蛋白的生物信息学分析

材料和方法

结果

讨论

第二章重组SjSCP1、SjSCP2的克隆表达、纯化和生物学鉴定

材料和方法

结果

讨论

第三章SjSCP1、SjSCP2特异性抗体对BALB/c小鼠日本血吸虫感染的作用

材料和方法

结果

讨论

总 结

参考文献

附录

致谢