日本血吸虫中国大陆株硫氧还蛋白基因及其克隆表达方法和应用

摘要

本发明涉及日本血吸虫(中国大陆株)硫氧还蛋白(SjcTrx)基因的序列及其克隆表达方法和应用。本发明公开的SjcTrx基因具有序列1所示的核苷酸序列及编码相应的氨基酸序列。本发明还公开了SjcTrx基因在大肠杆菌中的表达方法。经制备纯化重组蛋白和DNA疫苗，免疫C57BL/6小鼠，发现本发明SjcTrx基因可用于制备防治日本血吸虫病的重组蛋白疫苗和DNA疫苗。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及日本血吸虫(中国大陆株)硫氧还蛋白(SjcTrx)基因的序列及其克隆表达方法和应用。

背景技术

日本血吸虫病曾广泛流行于我国长江流域及其以南的12省、市、自治区，1950年代初，全国约有1160万血吸虫病患者，中间宿主钉螺分布面积148亿m²。经过半个多世纪不懈努力，我国的血吸虫病防治工作取得了举世瞩目的成就，至1995年，已有广东、上海、福建、广西、浙江等5省(区、市)达到了血吸虫病传播阻断标准。但是，近年来，我国血吸虫病流行范围有所扩大，血防工作形势比较严峻，突出表现在：血吸虫病感染人数增多，局部地区出现急性感染暴发疫情；部分地区疫情死灰复燃，疫区范围明显扩大并向城市蔓延；钉螺大面积扩散，人畜感染的危险增加。近几年报告病人数呈上升趋势，其中，急性感染人数明显增加，2002年比2001年增加59％，2003年又比2002年增加22％，并发生了30余起急性血吸虫病暴发疫情。2003年，全国还有110个县流行血吸虫病，病人84.3万，钉螺面积35亿m²以上；2004年仍有病人84.25万，钉螺面积38.46亿m²。血吸虫病的流行范围和有螺面积之广，病人数之多均居日本血吸虫病流行国家之首。灭螺和吡喹酮大规模化疗，实践证明并未根本解决血吸虫病防治问题。重复感染的问题严重存在、惟一有效化疗药物吡喹酮的长期使用可能产生抗药株和大量哺乳动物保虫宿主的存在，是我国血吸虫病防治工作面临的主要问题。因而寻找长效防治措施成为主要目标，鉴于疫苗预防作用的持效性和经济的特点，被作为血吸虫病综合防治重要的措施之一而倍受关注：化疗手段(短效)与长效的措施(疫苗)相结合。寻找疫苗新的候选抗原分子是日本血吸虫病疫苗研究的重点之一。

硫氧还蛋白(Trx)是一种有氧化还原作用的小分子量蛋白质，在体内具有抗过氧化、清除游离基、保护组织器官等作用，并与细胞凋亡、免疫调节、胚胎植入和发育有关。到目前为止，尚未见涉及本说明书中日本血吸虫中国大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)基因及其应用研究的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于公开日本血吸虫中国大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)基因序列，以及SjcTrx基因的克隆和在大肠杆菌中的表达方法，并公开SjcTrx基因在制备防治日本血吸虫病疫苗中的应用。

本发明依据公布的日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白基因序列设计引物，以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板，反转录PCR(RT-PCR)扩增SjcTrx基因的完整编码框，分别克隆到原核表达载体pET28a和真核表达载体pcDNA3中，分别构建了重组质粒pET28a-SjcTrx和pcDNA3-SjcTrx，并对克隆的基因核苷酸序列进行了测定。

本发明公开的SjcTrx基因具有序列1所示的核苷酸序列及序列2所示的编码相应的氨基酸序列。SjcTrx基因开放阅读框编码106个氨基酸，根据测序结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白有97％的同源性(见附图1)，与曼氏血吸虫硫氧还蛋白有43％的同源性(见附图2)。

本发明公开的SjcTrx基因在大肠杆菌中的表达方法是将SjcTrx基因克隆到原核表达质粒pET28a(+)中，构建重组质粒pET28a-SjcTrx，转化BL21表达菌后，用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示，重组质粒获得高效表达，表达蛋白分子量约14kDa，命名为reSjcTrx。

Western Blotting试验显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清和reSjcTrx重组抗原免疫小鼠血清识别，而与正常兔血清和正常小鼠血清无反应，说明reSjcTrx具有良好的抗原性。用Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白reSjcTrx，以纯化的重组蛋白作为抗原，免疫C₅₇BL/6小鼠，免疫剂量为15μg/鼠，共免疫3次，间隔2周。末次免疫后3周用日本血吸虫尾蚴攻击感染，攻击感染后6周剖杀小鼠，计数成虫数和肝内虫卵数。结果表明，与感染对照组相比，reSjcTrx加ISA720佐剂免疫组小鼠攻击感染后的减虫率和肝组织减卵率分别为22.8％和29.5％。

本发明研究发现，SjcTrx基因可用于制备防治日本血吸虫病疫苗。将SjcTrx基因克隆到真核表达质粒pcDNA3中，构建成DNA疫苗pcDNA3-SjcTrx。核酸疫苗注射C₅₇BL/6小鼠，SjcTrx可以在小鼠肌肉注射局部的肌细胞中表达。在C₅₇BL/6小鼠免疫保护试验中，每只小鼠经股四头肌注射100μg核酸疫苗，共注射3次，间隔2周。于末次免疫后3周用日本血吸虫尾蚴攻击感染，攻击感染后6周剖杀小鼠，计数成虫数和肝内虫卵数。结果表明，与感染对照组相比，核酸疫苗免疫组减虫率和肝组织减卵率分别为45.7％和41.4％，核酸疫苗和蛋白疫苗联合免疫组减虫率和肝组织减卵率分别为37.0％和31.6％。

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

附图说明

图1：日本血吸虫中国大陆株硫氧还蛋白与日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白同源比对分析

图2：日本血吸虫大陆株硫氧还蛋白与曼氏血吸虫硫氧还蛋白同源比对分析

图3：RT-PCR扩增目的基因及pET28a-SjcTrx重组质粒双酶切及PCR鉴定

1：1kb DNA marker；2：pET28a空质粒；3：pET28a-SjcTrx重组质粒；4：pET28a空质粒双酶切(BamHI和SalI)；5：pET28a-SjcTrx重组质粒双酶切(BamHI和SalI)；6：pET28a空质粒DNA为模板PCR产物；7：pET28a-SjcTrx重组质粒DNA为模板PCR产物；8：SjcTrx RT-PCR产物；9：100bp DNA Marker

图4：SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达及纯化

M：蛋白标准分子量；1：pET28a/BL21诱导前；2：pET28a/BL21诱导后4h；3：pET28a-SjcTrx/BL21诱导前；4：pET28a-SjcTrx/BL21诱导后4h；5：纯化的重组蛋白reSjcTrx

图5：Western Blotting对重组蛋白reSjcTrx的分析

M：蛋白标准分子量；1：与日本血吸虫感染兔血清反应；2：与日本血吸虫正常兔血清反应；3：与reSjcTrx重组抗原免疫鼠血清反应；4：与正常小鼠血清反应

图6：ELISA检测重组硫氧还蛋白(reSjcTrx)疫苗免疫小鼠血清特异性IgG抗体水平

图7：RT-PCR扩增目的基因及pcDNA3-SjcTrx重组质粒双酶切和PCR鉴定

1：1kb DNA marker；2：pcDNA3空质粒；3：pcDNA3-SjcTrx重组质粒；4：pcDNA3空质粒双酶切(BamHI和SalI)；5：pcDNA3-SjcTrx重组质粒双酶切(BamHI和SalI)；6：pcDNA3空质粒DNA为模板PCR产物；7：pcDNA3-SjcTrx重组质粒DNA为模板PCR产物；8：SjcTrx RT-PCR产物；9：100bp DNA Marker

图8：免疫染色试验检测核酸疫苗在小鼠肌肉组织中表达

A：pcDNA3-SjcTrx B：pcDNA3

图9：ELISA检测核酸疫苗(pcDNA3-SjcTrx)免疫小鼠血清特异性IgG抗体

具体实施方式

实施例1  日本血吸虫硫氧还蛋白基因克隆和表达及重组蛋白小鼠免疫保护试验

1.材料

1.1 日本血吸虫大陆株尾蚴和成虫：含成熟尾蚴的阳性钉螺由本所重点实验室提供，常规方法逸得尾蚴。日本血吸虫大陆株成虫(雌雄混合)，取自日本血吸虫尾蚴感染6周的家兔。

1.2 菌株及质粒：大肠杆菌BL21株和载体pET28a购自Novagen公司。

1.3 实验动物：6周龄C₅₇BL/6雌性小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供。

1.4 主要试剂：总RNA抽提试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、酶切产物纯化试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、反转录酶(AMV)、RNasin、T4DNA连接酶、限制性内切酶(BamHI和SalI)、羊抗鼠IgG-HRP等为美国Promega公司产品，Tris碱、琼脂糖、邻苯二胺(OPD)、二胺基联苯胺(DAB)和4-氯-1-萘酚等为美国Sigma产品，蛋白质纯化试剂盒购于Qiagen公司，MontanideISA720佐剂由法国Seppic公司提供，PVDF膜为美国BIO-RAD公司，Tryptone和Yeast Extract为OXOID公司产品，其它试剂均为国产分析纯。

1.5 目的基因引物的设计：分析日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白编码基因，设计一对引物：

上游引物1：5′-GCGGATCCATGAGTAACGTACTGCATATAG-3′

下         游         引       物        1      ：

5′-GCGTCGACTTAGCCATATTTCATATATAAGAGGCAC-3′

上游引物5′端引入限制性内切酶BamHI酶切位点(划线部分)和起始密码子(黑体)，下游引物5′引入限制性内切酶SalI酶切位点(划线部分)和终止密码子(黑体)。引物由上海生工生物工程公司合成。

2.方法

2.1 SjcTrx基因的扩增：

按总RNA抽提试剂盒方法提取日本血吸虫成虫总RNA，反转录生成cDNA第一链，操作按试剂盒说明书进行。以反转录产物为模板，PCR扩增SjcTrx基因。反应体系为：

10×reaction Buffer            5.0μl

上游引物                       11.0μl

下游引物                       11.0μl

dNTPs                          2.0μl

反转录产物                     5.0μl

Taq DNA聚合酶                  0.5μl

去离子水                       35.5μl

依次加入以上反应物，混匀后短时离心，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 45sec，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延长7min。

2.2 重组表达载体pET28a-SjcTrx的构建：

上述PCR产物进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，用PCR产物纯化试剂盒对目的片段进行割胶纯化。纯化PCR产物和质粒pET28a用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切，双酶切后的DNA片段用1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，用酶切产物纯化试剂盒进行割胶纯化。双酶切质粒pET28a(+)DNA和PCR产物酶切片段经T4DNA连接酶进行连接，4℃连接过夜。连接产物转化BL21(DE3)感受态细菌(冷氯化钙法制备)，将菌液涂布于含卡那霉素(Kan)(30μg/ml)的LB固体培养基上，于37℃培养过夜。

2.3 重组质粒pET28a-SjcTrx的鉴定：

采用限制性酶切酶BamHI和SalI双酶切、PCR和琼脂糖凝胶电泳对重组质粒DNA进行鉴定。对筛选获得的重组质粒进一步进行核苷酸序列测定进行鉴定，确定外源目的基因片段是否正确插入pET28a(+)载体中。

2.4 重组蛋白的诱导表达和纯化：

重组质粒pET28a-SjcTrx转化BL21菌液划LB固体培养基板(含Kan 30μg/ml)培养过夜，挑取单个菌落接种于3ml LB液体培养基(含Kan 30μg/ml)培养过夜，以1∶100稀释过夜培养菌于LB液体培养基(含Kan 30μg/ml)中，于37℃ 250转/分钟培养4h，加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mmol/L，诱导表达4h。离心收集菌体，超声破裂菌体后，离心取上清液通过Ni-NTA的亲和层析柱纯化目的蛋白，纯化的蛋白以紫外吸收法定量。

2.5 免疫印迹试验(Western blotting)：

纯化日本血吸虫大陆株硫氧还蛋白重组蛋白(reSjcTrx)经SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜，转膜条件为30V恒压转移1h。吸附蛋白的PVDF膜浸在含1％脱脂奶粉的0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS)中4℃封闭过夜。浸入一抗反应液(日本血吸虫感染兔血清1∶100稀释或reSjcTrx免疫小鼠血清1∶500稀释，5％小牛血清，稀释液为PBS)中37℃轻微振摇反应1h；用PBS-T(0.1％Tween-20)室温轻微振摇洗涤3次，每次5min；浸入二抗反应液(HRP标记羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG1∶1000稀释，5％小牛血清，稀释液为PBS)，37℃轻微振摇反应1h，PBS-T洗涤3次，每次5min；用PBS洗涤1次，二胺基联苯胺(DAB)和4-氯-1-萘酚显色，观察重组蛋白条带是否被以上血清抗体识别。

2.6 reSjcTrx免疫保护作用的观察：

将30只6周龄雌性C₅₇BL/6小鼠随机分为3组，每组10只：reSjcTrx疫苗免疫组、ISA720佐剂对照组和感染对照组。疫苗免疫组每只小鼠经项背部多点皮下注射乳化的15μg reSjcTrx重组抗原和ISA720佐剂，共免疫3次，间隔2周；佐剂对照组小鼠则注射乳化的生理盐水加ISA720佐剂，感染对照组小鼠不注射任何抗原或佐剂。末次免疫3周后，实验组及对照组每鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(30±1)条。尾蚴攻击感染6周后，解剖小鼠门脉灌注收集血吸虫成虫，计数每只小鼠中收集的血吸虫成虫数，计算疫苗免疫小鼠的减虫率：

每只小鼠肝组织分别剪碎后按常规方法用8％氢氧化钾消化，计数每只小鼠肝组织内血吸虫卵数，计算肝组织减卵率：

2.7 ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG抗体：

疫苗免疫组和2个对照组小鼠分别于免疫前、攻击感染前和剖杀前采血，分离血清，-20℃保存备用。用ELISA方法测定小鼠血清日本血吸虫硫氧还蛋白特异IgG抗体水平。reSjcTrx重组抗原1μg/孔包被；加小鼠血清稀释液(待测小鼠血清1∶80稀释，稀释液为0.01mol/LPBS)100μl/孔于37℃孵育1h，然后用PBS-T洗涤3次，每次5min；加羊抗鼠IgG稀释液(1∶1000稀释，稀释液同上)，于37℃孵育1h，PBS-T洗涤3次，每次5min；OPD显色液中显色20min，加2mol/LH₂SO₄终止反应，测得各组A₄₉₂值。

2.8 统计方法：

用SAS软件包对数据进行t检验分析。

3 结果

3.1 RT-PCR扩增目的基因及pET28a-Trx重组质粒鉴定：

SjcTrx编码基因PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测约334bp(见附图3)，与预计的大小一致。pET28a-Trx重组质粒DNA经BamHI和SalI双酶切及以重组质粒DNA为模板PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳，均见RT-PCR产物大小相似条带，而pET28a空质粒DNA经双酶切(BamHI和SalI)和PCR均未见此条带。

3.2 SjcTrx基因核苷酸序列测定和分析：

测序结果表明重组质粒pET28a-SjcTrx构建成功，证实SjcTrx编码106个氨基酸(序列2)，表达蛋白的相对分子量14000(14kDa，含载体6个组氨酸)，经同源比对分析后发现与日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白氨基酸序列的同源性为97％(见附图1)，与曼氏血吸虫硫氧还蛋白氨基酸序列的同源性为43％(见附图2)。

3.3 重组体诱导表达和重组抗原(reSjcTrx)的纯化：

将pET28a-SjcTrx/BL21工程菌用IPTG诱导表达后，在Mr14000(14kDa)处有一条特异的表达条带，而pET28a/BL21空质粒对照菌诱导后无此条带。表达蛋白经Ni-NTA纯化后也在Mr14000处有一条带(附图4)。

3.4 Western Blotting：

纯化reSjcTrx与日本血吸虫感染兔血清和重组抗原免疫小鼠血清有明显反应(附图5)。这说明重组硫氧还蛋白具有较好的抗原性和免疫反应性。

3.5 reSjcTrx免疫小鼠保护效果观察：

免疫小鼠攻击感染后6周剖杀，经门脉灌注收集成虫并计数，疫苗免疫组(reSjcTrx加ISA佐剂)与ISA720佐剂对照组和感染对照组比较，检获成虫数差异均有显著意义(P＜0.05)。与感染对照组相比，疫苗免疫组小鼠的减虫率为22.8％(表1)。

攻击感染后6周剖杀小鼠，收集分离小鼠肝组织内血吸虫虫卵并计数，疫苗免疫组(reSjcTrx加ISA佐剂)与ISA720佐剂对照组和感染对照组比较，虫卵数差异均有显著意义(P＜0.05)。与感染对照组相比，疫苗免疫组小鼠的减卵率为29.5％(表1)。

表1 日本血吸虫重组硫氧还蛋白(reSjcTrx)疫苗免疫小鼠的减虫

                        率和减卵率

  组别 Group  平均检获成  虫数  (x±s)  Average no.  of Worms   (x±s)  减虫率  (％)  Worm  reduction  rate   (％)  平均肝组织  虫卵数  (x±s)  Average no.of  eggs in liver  tissue   (x±s)  减卵率   (％)  Egg  reduction  rate  (％) reSjcTrx+ISA720佐剂 免疫组 ISA720佐剂对照组 感染对照组  14.2±4.1^*   19.9±7.3  18.4±3.8  22.8   -  -  8521±3278^*   11502±2642  12095±4172  29.5   4.9  -

注：与ISA720佐剂对照组和感染对照组比较，^*P＜0.05

3.6 ELISA检测重组蛋白reSjcTrx免疫小鼠血清特异性IgG抗体：

重组蛋白疫苗免疫组小鼠免疫后血清特异性IgG A值比佐剂对照组和感染对照组小鼠显著升高(P＜0.01)(附图6)。

实施例2、日本血吸虫硫氧还蛋白核酸疫苗的构建及核酸疫苗小鼠免疫保护试验

1 材料

1.1 日本血吸虫大陆株尾蚴和成虫：含成熟尾蚴的阳性钉螺由本所重点实验室提供，常规方法逸得尾蚴。日本血吸虫大陆株成虫(雌雄混合)，取自日本血吸虫尾蚴感染6周的家兔。

1.2 菌株及质粒：大肠杆菌JM109株购自Invotrogen公司和载体pcDNA3购自Novagen公司。

1.3 实验动物：6周龄C₅₇BL/6雌性小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供。

1.4 主要试剂：总RNA抽提试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、酶切产物纯化试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、反转录酶(AMV)、RNasin、T4DNA连接酶、限制性内切酶(BamHI和EcoRI)、羊抗鼠IgG-HRP等为美国Promega公司产品，Tris碱、琼脂糖、氨苄青霉素和邻苯二胺(OPD)等为美国Sigma产品，Tryptone和Yeast Extract为OXOID公司产品，其它试剂均为国产分析纯。

1.5 目的基因引物的设计：分析日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白基因，分析读码框，设计一对引物：

上游引物2：5′-gcggatccATG AGTAACGTACTGC-3′

下游引物2：5′-gcgaattcTCATTTGTGTTTCCGG-3′

上游引物引入BamHI酶切位点，下游引物引入EcoRI酶切位点。引物由上海生工生物工程公司合成。

2.方法

2.1 SjcTrx基因的扩增：

按总RNA抽提试剂盒方法提取日本血吸虫成虫总RNA，常规方法反转录生成cDNA第一链。以反转录产物为模板，PCR扩增SjcTrx基因。反应体系为：

10×reaction Buffer        5.0μl

上游引物2                  1.0μl

下游引物2                  1.0μl

dNTPs                      2.0μl

反转录产物                 5.0μl

Taq DNA聚合酶              0.5μl

去离子水                   35.5μl

依次加入以上反应物，混匀后短时离心，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 45sec，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延长7min。

2.2 重组表达载体pcDNA3-SjcTrx的构建：

上述PCR产物进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，用PCR产物纯化试剂盒对目的片段进行割胶纯化。纯化PCR产物和质粒pcDNA3用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切，双酶切后的DNA片段用1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，用酶切产物纯化试剂盒进行割胶纯化。纯化pcDNA3双酶切DNA片段和纯化PCR产物酶切片段经T4DNA连接酶进行连接，4℃连接过夜。连接产物转化JM109感受态细菌(冷氯化钙法制备)，将菌液涂布于含氨苄青霉素(Amp)(100μg/ml)的LB固体培养基上，于37℃培养过夜。次日挑取分隔良好的单个菌落分别于含Amp(100μg/ml)的LB培养液中培养扩增，抽提质粒DNA，用于进一步鉴定。

2.3 真核表达重组质粒pcDNA3-SjcTrx的鉴定和大量制备：

采用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对重组质粒DNA进行鉴定。对筛选获得的阳性克隆重组质粒进一步用核苷酸序列测序进行鉴定。鉴定正确的pcDNA3-SjcTrx/JM109工程菌单个菌落接种于含Amp(100μg/ml)的LB培养液中培养扩增，次日按1∶100比例加入LB液体培养基(含Amp100μg/ml)于37℃ 250转/分钟培养4h。离心收集菌体，用碱裂解法大量提取重组质粒pcDNA3-SjcTrx，溶于无菌生理盐水，经BamHI和EcoRI双酶切和核苷酸序列测定进行鉴定。紫外分光光度计测定质粒的A₂₆₀和A₂₈₀，计算含量和纯度分析。同法制备pcDNA3空质粒DNA作为对照。

2.4 免疫酶染色试验(IEST)观察DNA疫苗在肌肉注射的局部组织中的表达：

取6只6周龄雌性C₅₇BL/6小鼠，每鼠经股四头肌注射pcDNA3-SjcTrx DNA疫苗100μg，分别于注射后24小时、48小时和72小时取肌肉注射部位局部组织制备冰冻切片，用IEST检测注射局部组织中目的基因的表达情况，以注射pcDNA3空质粒者为对照(2只C₅₇BL/6小鼠)。取出冰冻切片，回复至室温，0.01mol/L PBS漂洗，用含3％小牛血清的0.01mol/L PBS于37℃封闭2h；加抗reSjcTrx免疫小鼠血清(1∶50稀释，5％小牛血清)37℃孵育1h，用PBS-T(1％Tween-20)洗涤3次，每次5min；加HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶100稀释)，37℃孵育1h；PBS-T洗涤3次，加DAB显色液，室温显色20min，PBS-T洗涤3次终止反应，光学显微镜下观察。

2.5  小鼠免疫保护作用观察：

将30只6周龄雌性C₅₇BL/6小鼠随机分为3组：pcDNA3-SjcTrx核酸疫苗免疫组、pcDNA3空质粒对照组和攻击感染对照组，每组10只小鼠。按10μl/克体重经腹腔注射0.75％戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠，核酸疫苗免疫组每只小鼠经股四头肌注射100μg pcDNA3-SjcTrx质粒DNA，共注射3次，间隔2周；空质粒对照组每只小鼠在相应时间经股四头肌注射100μg pcDNA3质粒DNA；感染对照组则不注射任何质粒DNA。末次免疫后3周，各组每鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(30±1)条。于攻击感染后6周，剖杀小鼠，门脉灌注收集成虫，小鼠肝组织用8％氢氧化钾消化后于显微镜下计数血吸虫虫卵数，并计算减虫率和减卵率。

各组小鼠分别于免疫前、攻击感染前和剖杀前采血，分离血清，-20℃保存，用于特异性抗体的检测。

2.6 ELISA检测免疫小鼠血清特异性抗体(IgG)水平：

用ELISA方法测定上述小鼠血清特异性IgG水平。重组抗原reSjcTrx 1μg/孔包被，加含5％小牛血清的0.01mol/L PBS 37℃封闭2h；加待测小鼠血清(1∶80稀释)37℃孵育1h；用PBS-T(含0.1％Tween-20)洗涤3次，每次5min；加HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶1000稀释)，37℃孵育1h；PBS-T洗涤3次，加OPD显色液显色，2mol/LH₂SO₄终止反应，测定各组A₄₉₂值。

2.7 统计方法：

用SAS软件包对数据进行t检验分析。

3.结果

3.1 RT-PCR扩增SjcTrx基因及pcDNA3-SjcTrx重组质粒鉴定：

SjcTrx编码基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测约334bp(附图7)，与预计大小一致。SjcTrx基因与pcDNA3原核表达载体连接而构建的重组质粒(pcDNA3-Trx)经BamHI和EcoRI双酶切及以重组质粒DNA为模板PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳，均见类似大小条带，而pcDNA3空质粒DNA经双酶切及PCR均未见此条带。

3.2 SjcTrx基因核苷酸序列测定：

经核苷酸序列测定验证，SjcTrx编码基因与上述蛋白疫苗基因完全一致(序列1和2)，表明SjcTrx的cDNA以正确的方向克隆入真核表达载体pcDNA3，重组pcDNA3-SjcTrx质粒构建成功。

3.3 核酸疫苗在小鼠肌肉组织中表达：

pcDNA3-SjcTrx注射小鼠肌肉组织免疫后，于不同时间取注射部位小鼠肌肉组织制备冰冻切片，IEST检测局部表达蛋白情况。结果，注射24h就有明显的SjcTrx蛋白表达，小鼠肌细胞内可见特异性片状或点状棕黄色染色，而空质粒免疫小鼠骨骼肌细胞内未见特异性染色颗粒(附图8)。表明pcDNA3-SjcTrx可在注射部位肌细胞内表达。

3.4 核酸疫苗免疫保护性作用观察：

攻击感染后6周，疫苗免疫组、空质粒对照组和攻击感染对照组平均检获成虫数分别为10.0、15.2和18.0条，疫苗免疫组与空质粒对照组和攻击感染对照组相比，差异均有显著性(P＜0.05)。与感染对照组相比，疫苗免疫组和空质粒对照组的减虫率分别为45.7％和17.4％(表2)。

疫苗免疫组、空质粒对照组和攻击感染对照组平均虫卵数分别为7086、8098和12095，疫苗免疫组与感染对照组相比差异有非常显著性(P＜0.01)。与感染对照组相比，疫苗免疫组和空质粒对照组的减卵率分别为41.4％和33.0％(表2)。

            表2 pcDNA3-SjcTrx核酸疫苗免疫小鼠减虫率和减卵率

  组别   Group  平均检获成  虫数(x±s)  Average no.   of worms  (x±s)  减虫率  (％)  Worm   reduction  rate(％)  平均肝组织虫  卵数(x±s)  Average no.of   eggs in liver  tissue(x±s)  减卵率  (％)  Egg   reduction  rate(％)  pcDNA3-SjcTrx疫苗免  疫组  pcDNA3-SjcTrx vaccine  pcDNA3空质粒对照组  pcDNA3 control  攻击感染对照组  Challenging infection  control  10.0±5.1(1)   15.2±4.3(2)    18.0±3.8  45.7   17.4    -  7086±4200(1)   8098±3384(2)    12095±4172  41.4   33.0    -

与感染对照组比较，(1)P＜0.01，(2)P＜0.05

3.5 免疫小鼠血清特异性IgG水平：

核酸疫苗免疫组小鼠免疫后血清特异性IgG A值比空质粒和攻击感染对照组显著升高(P＜0.05)，而空质粒对照组与攻击感染对照组无明显差异(P＞0.05)(附图9)。

                            序列表

<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

<120>日本血吸虫中国大陆株硫氧还蛋白基因及其克隆表达方法和应用

<130>说明书、权利要求书

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>321

<212>DNA

<213>日本血吸虫中国大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)基因序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(318)

<400>1

atg agt aac gta ctg cat ata gaa acc gat gac gat ttt gat tct ttc    48

Met Ser Asn Val Leu His Ile Glu Thr Asp Asp Asp Phe Asp Ser Phe

1               5                   10                  15

tta aag gaa aat aag gat aaa tta att gtt gtt gat ttt ttc gca act    96

Leu Lys Glu Asn Lys Asp Lys Leu Ile Val Val Asp Phe Phe Ala Thr

            20                  25                  30

tgg tgt ggg ccg tgt aaa aaa ata gct cct gct ttc gaa gcg ttg agc   144

Trp Cys Gly Pro Cys Lys Lys Ile Ala Pro Ala Phe Glu Ala Leu Ser

        35                  40                  45

gct gat cgt tcg gca tta tat gtg aag gtt gac gtg gat aaa ctt gaa   192

Ala Asp Arg Ser Ala Leu Tyr Val Lys Val Asp Val Asp Lys Leu Glu

    50                  55                  60

gaa act gcc aaa aga tac gat gta aca gct atg cca acg ttt att gtg   240

Glu Thr Ala Lys Arg Tyr Asp Val Thr Ala Met Pro Thr Phe Ile Val

65                  70                  75                  80

ata aaa aat ggc gaa aaa gtc gat aca gtg gtt gga gct tct ata gaa    288

Ile Lys Asn Gly Glu Lys Val Asp Thr Val Val Gly Ala Ser Ile Glu

                85                  90                  95

aat gtt gaa gct gcg atc agg aaa cac aaa taa                        321

Asn Val Glu Ala Ala Ile Arg Lys His Lys

            100                 105

<210>2

<211>106

<212>PRT

<213>日本血吸虫中国大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)基因序列

<400>2

Met Ser Asn Val Leu His Ile Glu Thr Asp Asp Asp Phe Asp Ser Phe

1               5                   10                  15

Leu Lys Glu Asn Lys Asp Lys Leu Ile Val Val Asp Phe Phe Ala Thr

            20                  25                  30

Trp Cys Gly Pro Cys Lys Lys Ile Ala Pro Ala Phe Glu Ala Leu Ser

        35                  40                  45

Ala Asp Arg Ser Ala Leu Tyr Val Lys Val Asp Val Asp Lys Leu Glu

    50                  55                  60

Glu Thr Ala Lys Arg Tyr Asp Val Thr Ala Met Pro Thr Phe Ile Val

65                  70                  75                  80

Ile Lys Asn Gly Glu Lys Val Asp Thr Val Val Gly Ala Ser Ile Glu

                85                  90                  95

Asn Val Glu Ala Ala Ile Arg Lys His Lys

            100                 105