海葵强心肽发酵工艺与临床前毒理学研究

摘要

海葵(Anthopleura)，属腔肠动物门(Soelenterata)，珊瑚纲(Anthozoa)。在长期的生物进化过程中，为了抵御敌害及捕获食物，海葵触手的刺丝囊能够分泌多种毒素，这些毒素大部分是多肽类毒素，对人和动物有多种活性作用。
　　 海葵毒素能专一地和兴奋组织(如神经、心肌、骨骼肌)细胞膜上电压依赖Na+通道结合，增强心肌的收缩，所以又称这类海葵毒素为海葵强心肽。因此，研究海葵强心肽，对设计、开发抗心衰药物有一定的意义。
　　 在实验室前期的研究中，已经利用基因工程手段，构建了海葵强心肽(Cardiactide)基因HK2a的融合表达质粒pTRX-HK2a，海葵强心肽基因在原核表达系统大肠杆菌中获得了高效的可溶表达。本文在本实验室以前研究的基础上，进行了Cardiactide在大肠杆菌表达体系中发酵条件的摸索，优化了发酵条件，在菌体密度OD600值达到20左右时，用200uMIPTG连续诱导8小时后，可得到湿重菌体60g/L，基本满足中试生产的需要。
　　 在中试发酵工艺确定的基础上，对海葵强心肽进行了较为系统的毒理学研究。通过急性毒性试验，测定Cardiactide对大鼠LD50值为1618ug/kg，据此，Cardiactide属于高毒物质；在Cardiactide对大鼠长期毒性试验中，通过测定血液学指标、血液生化学指标并结合病理组织学切片观察，发现海葵强心肽在连续静脉注射2周后，对大鼠的心脏和肝脏均有不同程度的损伤，但在停药2周后，心脏和肝脏的损伤均得到不同程度的恢复，损伤具有可逆性；通过对巴比系小鼠和家兔的免疫原性试验，家兔局部刺激性试验，家兔体内、体外溶血性试验和豚鼠的主动全身过敏性试验，发现海葵强心肽对于巴比系小鼠和家兔无免疫原性，对家兔无局部刺激性、溶血性，且对豚鼠也无致敏性反应发生。
　　 总之，对海葵强心肽发酵条件的优化及其毒理学研究的进一步深入，为该候选药物进入临床研究提供了基本的数据，同时对加深海葵强心肽生物学特性的认识具有重要的意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

第一章前言

1.1海葵

1.2海葵毒素

1.3强心类药物

1.4候选药物的毒理学研究

1.5本课题研究的目的和意义

1.6技术路线

第二章 海葵强心肽大肠杆菌表达体系发酵条件的优化

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

第三章 海葵强心肽的急性和长期毒性实验研究

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

第四章海葵强心肽免疫原性、局部刺激性、溶血性以及主动全身过敏实验

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

4.4小结

总结与展望

参考文献

附录

致谢