微藻电击转化方法的建立及新型载体的构建

摘要

杜氏盐藻(Dunaliella salina)和莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)均为单细胞真核绿藻，因其有着生长周期短、光合自养、培养基低廉以及容易进行实验操作等优点，具有重要的生物工程应用价值，是理想的生物反应器。本文成功建立了针对杜氏盐藻和莱茵衣藻的电击转化方法，构建了含酵母自主复制序列和着丝粒序列的新型载体并进行了转化，分析了其稳定性。
　　 (1)考察了两种微藻对氯霉素(Chloramphenicol)、博莱霉素(Zeocin)、氨苄青霉素(Ampicillin)、潮霉素(Hygromycin)以及卡那霉素(Kanamycin)几种常用抗生素的敏感性，分别确定了其遗传转化的筛选标记以及筛选转化子的最佳抗生素浓度。对于杜氏盐藻，氯霉素是比较合适的筛选抗生素，其对应的筛选标记基因是CAT基因，液体培养时的筛选浓度为400μg/ml，固体平板培养时的筛选浓度为200μg/ml对于莱茵衣藻，最佳的筛选抗生素为博莱霉素，其对应的抗性基因为ble基因，液体培养时的筛选浓度为0.2μg/ml，固体平板培养时的筛选浓度为2μg/ml。
　　 (2)利用电击法将质粒pCAT3-control转入了杜氏盐藻，研究了电击转化条件、藻的生长状态对转化率的影响，结果得出培养10天的盐藻细胞在7 kV/cm的脉冲电场强度、50μF电容、400Ω电阻条件下可获得较高的转化率。利用电击法将质粒pSP124S成功转化了莱茵衣藻，结果在500V/cm和1000V/cm的脉冲电场强度下都可以获得较高的转化率。
　　 (3)构建了两种含有酵母自主复制序列(ARS)和着丝粒序列(CEN)的质粒载体pCAT3-CEN和pSP-CEN，并将其分别转化了杜氏盐藻和莱茵衣藻，对其转化率和稳定性进行了研究。结果发现，酵母ARS和CEN序列的掺入并没有提高转化效率，也不能提高外源基因在微藻细胞中的稳定性。
　　 以上工作明确了杜氏盐藻和莱茵衣藻的筛选标记，成功建立了其电击转化体系。在此基础上，构建了新型载体并进行了转化莱茵衣藻和杜氏盐藻的初步研究，为真核微藻表达系统的载体构建拓宽了思路。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1外源基因表达系统的研究现状及展望

1.2微藻表达系统的研究进展及前景

1.3本文的研究意义

第二章杜氏盐藻和莱茵衣藻筛选标记的确定

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3结果和讨论

2.4小结

第三章杜氏盐藻和莱茵衣藻的电击转化

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3结果与讨论

3.4小结

第四章裁体pSP-CEN及pCAT3-CEN的构建

4.1人工染色体概述

4.2实验材料

4.3实验方法

4.4结果与讨论

4.5小结

第五章裁体pCAT3-CEN及pSP-CEN的转化

5.1实验材料

5.2实验方法

5.3结果与讨论

5.4小结

总结与展望

参考文献

附录

致谢