传染性脾肾坏死病毒VP23R、VP48R和VP92R的功能研究

摘要

肿大细胞病毒(Megalocytivirus)隶属虹彩病毒科(Iridoviridae),是养殖鱼类危害最大的病毒之一,可以感染60多种淡水和海水鱼类。器官出血、腹水增多等脉管系统病变,是导致鱼类死亡的主要因为。VP23R和VP48R是肿大细胞病毒属病毒所共有的基因,研究表明,VP23R具有层粘连蛋白同源区,VP48R隶属VEGF家族基因,这两个基因的功能都与脉管系统有关。本文对VP23R和VP48R在ISKNV感染过程中的功能进行研究。VP23R的292—576与鳜的lamininγIII2—6序列有44.5％的同源性,这个同源区是laminin与nidogen相互作用的结合位点。免疫荧光证实VP23R定位于被感染细胞的外膜上,但并不是病毒的囊膜蛋白。免疫共沉淀证实VP23R可以与nidogen-1相互作用。免疫组化和电镜实验表明VP23R和nidogen在ISKNV感染肿大细胞外形成一个类基底膜结构为内皮细胞的贴附提供位点；免疫组化表明肿大细胞外贴附的内皮细胞为淋巴管内皮细胞特异性标志物Prox-1阳性,证明其为淋巴管内皮细胞。我们构建了缺失VP23R基因的ISKNV突变株,缺失VP23R之后的ISKNV只能在MFF-1培养细胞中传代一次,表明VP23R的功能与细胞的传代有关。为了研究VP48R基因的功能,我们构建了缺失VP48R基因的ISKNV突变株,VP48R缺失的病毒对活体鳜组织细胞的感染率大幅度降低,免疫组化证实ISKNV感染的细胞类型为淋巴管内皮细胞,表明VP48R的功能是作为淋巴管内皮细胞生长因子促进ISKNV的靶细胞——淋巴管内皮细胞的增殖为病毒的侵染提供更多的宿主。我们还研究了ISKNV线粒体定位蛋白VP92R的功能,先前的研究表明,VP92R可以促进黑色素瘤的恶变,本研究通过蛋白双向电泳技术,对稳定表达VP92R基因的B16F0黑色素瘤细胞的全细胞及线粒体蛋白组进行了研究,证明VP92R的促肿瘤恶变作用可能与P53抑癌基因信号通道的抑制有关。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

一 肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)

二 ISKNV与脉管系统病变

三 病毒感染的线粒体病变

四 本研究的目的和意义

第二章 VP23R的功能研究

2.1 材料

2.1.1 重组质粒、菌株、细胞株实验动物

2.1.2 定量PCR试剂

2.1.3 缓冲液及溶液

2.1.4 抗体

2.1.5 石蜡组织切片和免疫组化检测所用的试剂和溶液

2.1.6 免疫共沉淀相关试剂

2.2 方法

2.2.1 鳜鱼仔鱼细胞的传代培养

2.2.2 病毒基因组拷贝数绝对定量

2.2.3 DNA的提取

2.2.4 病毒基因组拷贝数测定

2.2.5 病毒滴度(TCID50)测定

2.2.6 病毒感染

2.2.7 感染病毒细胞总RNA的提取

2.2.8 cDNA一链合成

2.2.9 Real-time RT-PCR引物的设计与筛选

2.2.10 Real-time RT-PCR反应

2.2.11定量数据处理与分析

2.2.12石蜡切片的制作

2.2.13免疫荧光

2.2.14免疫组化

2.2.15免疫共沉淀

2.2.16透射电镜

2.2.17 VP23R基因敲除

2.3 结果

2.3.1 病毒液的滴度及病毒基因组拷贝数绝对定量

2.3.2 VR23R序列的同源性分析

2.3.3 VP23R在ISKNV感染MFF-1细胞中的表达时相

2.3.4 VP23R和MCP在感染组织中表达的时间顺序

2.3.5 VP23R和nidogen-1的相互作用

2.3.6 ISKNV感染鳜组织细胞外贴附淋巴管内皮细胞的研究

2.3.7 VP23R基因的敲除

2.3.8 VP23R的敲除

2.4 讨论

第三章 VP48R基因的功能研究

3.1 实验方法

3.2 实验结果

3.2.1 VP48R的表达时相

3.2.2 VP48R的敲除

3.2.3 敲除VP48R基因的ISKNV的致病性研究

3.2.4 缺火VP48R基因后未影响ISKNV感染肿大细胞外贴附淋巴管内皮细胞现象的形成

3.2.5 ISKNV感染细胞类型的鉴定

3.3 讨论

第四章 VP92R的功能研究

4.1 材料

4.I.1缓冲液及溶液

4.1.2 仪器

4.2 方法

4.2.1 定量PCR

4.2.2 稳定表达VP92R基冈的B16F0细胞的筛选

4.2.3 线粒体及胞质组分分离

4.2.4 蛋白双向电泳

4.3 实验结果

4.3.1 VP92R的表达时相

4.3.2 稳定表达VP92R基冈的B16F0细胞线粒体的蛋白组学分析

4.3.4 稳定表达VP92R基因的B16F0细胞中P53通道蛋白的转录

4.4 讨论

全文总结

参考文献

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