布氏锥虫细胞分裂调控和大/小鼠巨噬细胞抗弓形虫感染机制的研究

摘要

布氏锥虫(Trypanosoma brucei,T.brucei)是一种广泛流行于非洲的细胞外寄生原虫。作为一种典型的原始单细胞生物,T.brucei还是研究细胞周期机制的重要模型。在众多参与细胞周期调控的蛋白中,染色体乘客复合体(chromosomal passenger complex,CPC)与保罗样激酶-1(Polo-like kinase-1,PLK-1)在控制细胞有丝分裂和胞质分裂过程中发挥着极其重要的作用。研究发现,布氏锥虫保罗样激酶(TbPLK)和染色体乘客复合体(TbCPC)都可以控制布氏锥虫细胞分裂的启动。但是,只有当TbCPC定位到鞭毛附着区(flagellumattachmentzone,FAZ)前端时,才能启动细胞分裂。在哺乳动物细胞中,PLK-1和CPC的互作已经被认为在启动细胞分裂过程中起着重要的作用。由于TbPLK在S期合成后始终定位于FAZ,我们猜测TbPLK可能引导TbCPC定位于FAZ,然后启动细胞分裂。
　　 本研究利用RNA干扰技术和药物化学手段抑制TbPLK的表达或酶活性,并把细胞同步化至不同的时期,观察TbPLK被抑制后对细胞周期和TbCPC定位的影响。首先,我们发现TbPLK在TbCPC移动到FAZ前端之前就已经被代谢,因此TbPLK并不是直接和TbCPC形成复合体。我们接着利用PLK抑制剂GW抑制了S后期细胞的TbPLK活性。结果显示,在细胞释放后,TbCPC依然能定位到FAZ前端,帮助细胞完成第一轮细胞分裂；但在第二轮细胞周期,TbCPC却无法定位到FAZ,同时造成细胞分裂被抑制。当用GW处理G1期细胞或用RNAi直接敲除TbPLK后,发现TbCPC在细胞释放后第一个周期内就无法定位到FAZ前端,同时也造成细胞分裂被迅速阻断。我们的研究结果证明,TbPLK能间接引导TbCPC复合体定位到FAZ上,从而启动细胞分裂。本实验结果对研究非洲锥虫如何启动细胞分裂的问题具有重要的理论指导意义。
　　 弓形虫(Toxoplasma gondii,T.gondii)是一种呈世界性分布的机会性致病原虫。由于其广泛的分布性,复杂的生活史和重要的致病性,弓形虫也是世界公认的研究宿主细胞和寄生虫相互关系的理想模型。巨噬细胞可通过诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)利用其底物L-精氨酸产生一氧化氮(nitric oxide,NO),后者是杀灭或抵抗病原生物的重要因子。然而,巨噬细胞内的精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)与iNOS竞争利用同一底物,抑制NO产生,并通过精氨酸酶代谢途径生成多胺类物质,后者则有利于胞内病原生物的生长。
　　 本研究以大/小鼠巨噬细胞为模型,研究iNOS和arginase在宿主细胞抗弓形虫感染过程中的相互作用。首先,我们实验发现弓形虫可以在小鼠巨噬细胞内大量增殖并导致被感染细胞的破裂；而所用的5种品系实验大鼠对弓形虫的抗性普遍较强,其中SD,Wistar和Lewis大鼠巨噬细胞对弓形虫具有很强的抗性,能够抑制弓形虫的增殖甚至杀灭弓形虫；而BN和F344大鼠巨噬细胞对弓形虫RH株则较为敏感,特别是BN大鼠,弓形虫可在其巨噬细胞内大量增殖,并导致细胞破裂。我们研究发现,大鼠巨噬细胞内iNOS的表达水平和NO量很高而Arg-1则极低；而在小鼠巨噬细胞内,这种情况正好相反。五种大鼠中,对弓形虫抗性最强的Lewis大鼠细胞内的iNOS和NO水平最高,而对弓形虫最为敏感的BN大鼠细胞内的iNOS和NO水平最低。我们还证明,当大/小鼠巨噬细胞内的NO被刺激或抑制后,细胞对弓形虫的抗性也随之增强或减弱。进一步研究发现,BN×Lewis F1代杂合子大鼠巨噬细胞的iNOS表达和NO产生水平以及对弓形虫的抗性都介乎于亲本大鼠Lewis和BN之间。此外,我们发现当小鼠巨噬细胞的精氨酸酶活性被抑制后,NO水平显著提高,同时弓形虫在细胞内的增殖也被明显抑制,说明arginase对胞内NO的产生起负调控作用。
　　 我们实验结果还显示,弓形虫感染大鼠巨噬细胞后,一方面可以部分抑制巨噬细胞iNOS的表达水平,降低NO的产生；另一方面可以提高Arg-1的表达水平和酶活性。感染弓形虫的比例越大,iNOS被抑制的程度和Arg-1被刺激的程度也就越强。
　　 总之,从宿主对弓形虫影响方面来讲,iNOS和arginase作为一对相互调节的因子,在巨噬细胞抗弓形虫感染方面发挥着极其重要的作用。从弓形虫感染对宿主巨噬细胞影响的方面来讲,弓形虫感染后能抑制NO并提高arginase活性,则是为了能在巨噬细胞内生存,逃避宿主攻击的一种手段。

目录

文摘

英文文摘

上篇 锥虫部分

第一章 绪论

第一节 布氏锥虫(Trypanosoma brucei)概述

第二节 染色体乘客复合体与保罗样激酶-1

第三节 研究目的和意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三章 结果与分析

第一节 PLK-1抑制剂和TbPLK-RNAi对锥虫生长和细胞周期的影响

第二节 TbPLK对TbCPC1定位和功能的影响

第三节 TbPLK对TbAUK1定位和功能的影响

第四节 TbPLK对TbCPC2定位和功能的影响

第四章 讨论

4.1 锥虫细胞同步化

4.2 GW抑制TbPLK酶活与RNAi抑制TbPLK表达

4.3 TbCPC

4.4 TbPLK与TbCPC

4.5 总结

下篇弓形虫部分

第一章 前言

第一节 弓形虫的生物学特性与致病性

第二节 弓形虫与宿主的相互关系

第三节 巨噬细胞与弓形虫感染

第四节 研究目的、意义及技术路线

第二章 材料和方法

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三章 结果与分析

第一节 巨噬细胞iNOS和arginase与弓形虫感染的关系研究

第二节 BN×Lewis F1代杂交鼠巨噬细胞对弓形虫感染的抗性研究

第三节 弓形虫感染对大鼠巨噬细胞iNOS和arginase的影响

第四章 讨论

4.1 大/小鼠巨噬细胞与弓形虫感染

4.2 NO与弓形虫

4.3 精氨酸酶与弓形虫感染

4.4 弓形虫感染对iNOS和arginase的影响

4.5 总结

参考文献:锥虫部分

参考文献:弓形虫部分

缩略词

攻读博士学位期间发表的论文

致谢

后记