细粒棘球绦虫基因工程疫苗候选分子EgA31的原核表达及免疫学鉴定

摘要

背景与目的：包虫病是由细粒棘球绦虫的幼虫引起的一种人畜共患病,在我国牧区广泛流行,严重影响了牧区人民的健康并造成畜牧业的经济损失(1,2)。目前对该病的控制主要以犬的驱虫和对牧民的预防教育为主,但在发展中国家效果较差(3,4)。疫苗预防将是控制该病的理想途径。理论上,通过对中间宿主(羊、牛等家畜)或终末宿主采取有效的免疫保护均能切断细粒棘球绦虫生活史的循环链,阻断包虫病的流行。用于中间宿主(羊)的疫苗研究方面已取得较理想的结果。Lightowlers等(12,13)报道了抗囊性包虫病的重组疫苗 EG95,对羊的免疫保护率可达到96-100％,但由于牧区羊的数量巨大,牲畜疫苗免疫的实施费用较高,操作繁劳,难以被社会接受。
　　犬是细粒棘球绦虫的终末宿主,控制了犬的感染就中断了虫卵的传播,从而保护中间宿主(包括人)免受感染,且牧区犬的数量远少于牛、羊等家畜,因此对终末宿主犬的免疫保护应是非常有效的途径。Fu等(5,6)用感染犬血清在一细粒棘球绦虫 cDNA表达文库中筛选出一66kDa cDNA克隆 EgA31,该cDNA克隆5′端表达多肽可引起显著的宿主体液免疫和细胞免疫。为了获得更好的抗原性及免疫原性,本研究通过原核表达系统获得 EgA31 cDNA3′端表达多肽,对其抗原性和免疫原性进行分析、鉴定,为进一步将 EgA31用于诊断及疫苗的研究奠定基础。
　　材料和方法：(1)通过 PCR方法扩增 EgA31cDNA,将得到的cDNA片断用限制性内切酶酶切,然后亚克隆入 pGEX-5X-3表达质粒,鉴定、筛选阳性质粒, DNA测序仪测序。
　　(2)将阳性重组质粒转化 Escherichia coli BL21宿主菌, IPTG诱导重组质粒的表达,优化表达条件。大量表达融合蛋白,GSTrapFF柱亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE鉴定表达产物的分子量及纯化效果, Bradford法测定重组蛋白含量。(3)用纯化的融合蛋白免疫豚鼠,获得抗血清, ELISA法检测豚鼠抗体水平, Western blot法进行分析鉴定。
　　研究结果：(1) PCR扩增得到500bp cDNA片断,亚克隆入pGEX载体,经酶切和 PCR方法鉴定结果表明 pGEX/EgA31重组质粒成功构建。测序检验重组质粒中 EgA31cDNA序列无误。开放读码框正确。
　　(2) SDS-PAGE结果显示分离纯化的 EgA31/GST融合蛋白分子量大小约为45kDa,GSTrapFF柱亲和层析纯化表达产物得到较高纯度的融合蛋白,蛋白表达量可达到每升培养基15mg重组蛋白。
　　(3) ELISA结果显示 EgA31/GST融合蛋白可激起豚鼠体内较强的体液免疫反应, IgG水平明显增高。免疫豚鼠得到的抗血清可与细粒棘球绦虫原头蚴总蛋白在66kDa处特异性反应。并与其它虫体蛋白之间存在交叉反应。
　　结论：(1)成功构建 pGEX/EgA31重组质粒。
　　(2) EgA31/GST融合蛋白获得高效表达,并成功纯化,具备被进一步制备为工程菌的条件。
　　(3)融合蛋白可激起豚鼠较强的体液免疫反应,并与其它虫体蛋白之间存在交叉反应,为进一步将 EgA31用于疫苗的研究奠定基础,并为将其用于其它虫体疫苗提供可能。

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

一、 材料

1. 实验动物

2. 质粒及菌株

3. 主要试剂

4. 主要仪器

二、实验方法

1. pGEX/EgA31 重组质粒的构建与鉴定

2. 重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化

3. EgA31/GST 融合蛋白的免疫学检测

实验结果

1. pGEX/EgA31 重组质粒的构建与鉴定

2. 重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化

3. EgA31/GST 融合蛋白的免疫学检测

讨论

结论

参考文献

附录 1

附录 2

致谢

包虫病的流行及控制（综述）

参考文献