脐血树突状细胞介导的食管癌疫苗体内抗癌效应

摘要

目的:
　　利用杂交瘤技术制备脐血树突状细胞(DC)和食管癌细胞EC109融合疫苗EC109-DC,观察其在体内诱导抗肿瘤免疫反应。
　　方法:
　　1)利用 Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离脐静脉血单个核细胞,免疫磁珠法分离脐血CD34+干细胞。
　　2)脐血 CD34+干细胞体外用细胞因子 GM-CSF(300ng/ml)、TNF-α(150u/ml)和SCF(200ng/ml)诱导分化培养,37℃、5％CO2饱湿条件下培养2周,隔日半保留换液并补加相应细胞因子,2周后收集成熟DC细胞。
　　3)聚乙二醇法(polyethyleneglycol, PEG)将DC与食管癌细胞EC109按5:1比例融合, HLA-DR MicroBeads标记, Mini MACS免疫磁式细胞分选器筛选阳性融合细胞EC109-DC。
　　4)对数生长期EC109、成熟DC、融合疫苗EC109-DC,分别用FA-FITC、CD80-PE进行标记,应用流式细胞分析技术鉴定融合疫苗表型。
　　5)融合疫苗通过SCID小鼠尾静脉及腹腔分别注射,进行体内致瘤性实验,观察小鼠是否诱生肿瘤,观察结束取小鼠脾、肝、肾等器官,石蜡切片,HE染色光镜观察。
　　6)人外周血淋巴细胞(PBL)小鼠腹腔注射,重建SCID小鼠人免疫系统,定期尾静脉取血,离心得血清,以生物素-亲和素夹心ELISA法测定鼠血清中人IgG含量以判断重建结果。
　　7)体内抗肿瘤免疫保护实验。取免疫系统重建成功SCID小鼠20只,随机分为ED、D、E和P4组,每组分别用融合细胞活疫苗、DC、灭活的EC109细胞和PBS通过尾静脉预免疫动物,再腋下接种活EC109细胞。观察比较小鼠体重、肿瘤出现时间、肿瘤大小、小鼠死亡时间及病理切片。
　　8)体内抗肿瘤免疫治疗实验。取重建免疫系统成功SCID小鼠20只,待右侧腋下荷瘤成功后,随机分为ED、D、E和P4组,分别用融合细胞活疫苗、DC、灭活的EC109细胞和PBS治疗动物。观察比较小鼠体重、肿瘤重量、肿瘤大小、小鼠死亡时间及病理切片。
　　结果:
　　1)免疫磁珠法分离的脐血 CD34+干细胞在细胞因子 GM-CSF、TNF-α和SCF诱导作用下开始增殖,第3天开始出现形态不规则细胞,并有簇状细胞集落形成,7天时集落增大,边缘毛刺状,2周时集落数量减少,散在的悬浮细胞增多,呈成熟的DC形态。
　　2)EC109和DC可在体外经PEG法成功融合,融合疫苗EC109-DC在体外培养可生长,呈半贴壁生长,胞核大,形状不规则,边缘伴有小突起。
　　3)经流式细胞分析技术分析,EC109高表达FR不表达CD80,DC高表达CD80不表达FR,疫苗则同时高表达FR和CD80。
　　4)融合疫苗接种于SCID小鼠体内未见肿瘤形成,脾、肾和肝等器官未出现肿瘤病变。
　　5)免疫重建PBL组均检测到人IgG的存在,与PBS组相比较P<0.05。
　　6)免疫保护组:经融合疫苗免疫的小鼠,肿瘤潜伏期较对照组明显延长(P<0.05),肿瘤大小和肿瘤重量均明显小于对照组(P<0.05)。
　　7)免疫治疗组:用融合疫苗治疗的荷瘤小鼠,肿瘤大小和重量明显小于对照组(P<0.05)。
　　结论:
　　1)经流式细胞分析技术分析显示,EC109高表达FR。
　　2)经PEG法融合和Mini MACS免疫磁式细胞分选法筛选的融合疫苗EC109-DC同时高表达EC109和DC特异性抗原,提示融合成功。
　　3) DC与EC109的融合疫苗无体内致瘤性,已失去其亲本EC109细胞的恶性生长特征,安全可靠。
　　4)融合疫苗对EC109细胞的攻击有明显的免疫保护作用。
　　5)融合疫苗治疗荷瘤小鼠有一定的抑瘤效应。

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缩 略 词

第1章 前 言

第2章 材料与方法

2.1 主要仪器和设备

2.2 主要试剂

2.3 细胞株和动物

2.4 脐带血

2.5健康人外周血

2.6细胞培养主要试剂及配制

2.7 肿瘤细胞准备

2.8人脐血CD34+干细胞分离纯化

2.9脐血DC体外扩增培养

2.10食管癌DC疫苗的制备（PEG法）[24]

2.11融合细胞筛选和体外培养

2.12融合疫苗EC109-DC的鉴定

2.13 动物准备

2.14融合疫苗体内致瘤性实验

2.15重建SCID小鼠免疫功能

2.16保护性免疫反应的诱导

2.17治疗荷瘤小鼠

2.18统计学处理

第3章 实验结果

3.1脐血DC的分离扩增和形态特征

3.2融合疫苗EC109-DC的生物学特性

第4章 讨 论

第5章 结 论

参考文献

附图

文献综述树突状细胞肿瘤疫苗研究进展及在消化道肿瘤的应用

附录

致谢