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蝴蝶兰栽培品种(系)细胞学、同工酶和RAPD研究

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第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 蝴蝶兰染色体数目和倍性多样性分析

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 蝴蝶兰小孢子母细胞减数分裂过程观察

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3 蝴蝶兰同工酶电泳

2.3.1 染色液配制及染色

2.3.2 结果记录

2.3.3 POD同工酶电泳条件优化

2.3.4 蝴蝶兰亲子代POD同工酶分析

2.3.5 蝴蝶兰不同花色品系POD同工酶电泳

2.4 蝴蝶兰RAPD分析

2.4.1 蝴蝶兰DNA样品制备

2.4.2 不同花色蝴蝶兰品种(系)的RAPD分析

第3章 结果与分析

3.1 蝴蝶兰染色体数目、倍性及分析

3.1.1 影响染色体标本制片效果的因素

3.1.2 蝴蝶兰染色体数目和倍性多样性

3.1.3 蝴蝶兰品种(系)的染色体形态

3.2 蝴蝶兰品种(系)小孢子母细胞减数分裂

3.2.1 花蕾大小与小孢子母细胞减数分裂时期的对应关系

3.2.2 不同倍性蝴蝶兰品种(系)小孢子母细胞减数分裂观察

3.3 蝴蝶兰同工酶分析

3.3.1 Amy、Est、POD同工酶分析

3.3.2 蝴蝶兰亲子代POD同工酶

3.3.3不同花色蝴蝶兰POD同工酶电泳

3.4 RAPD分析

3.4.1 蝴蝶兰总DNA的制备

3.4.2 引物的筛选

3.4.3 RAPD聚类分析

第4章 讨论

4.1蝴蝶兰品种(系)染色体数目和倍性多样性的研究

4.1.1 酶解法制片

4.1.2 蝴蝶兰品种(系)倍性多样性和核型多样性

4.1.3 对几个蝴蝶兰品种(系)的倍性、染色体形态及其育性特点的探讨

4.1.4 蝴蝶兰品种(系)小孢子母细胞减数分裂过程

4.2同工酶电泳

4.2.1 Est、Amy和POD同工酶分析

4.2.2 不同花色蝴蝶兰POD同工酶电泳

4.3 关于蝴蝶兰基因组DNA的制备

4.4 蝴蝶兰RAPD分析及几个因素对试验结果的影响

参考文献

附录

致谢

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摘要

蝴蝶兰属(Phalaenopsis)是兰科(Orchidaceae)植物的一个重要类群。由于蝴蝶兰属与多个近缘属,如五唇兰属(Doritis)、朵丽蝶兰属(Doritaenopsis)之间都有较好的杂交亲和性,多数杂种之间还能进行杂交繁育,种内、种间异花授粉和长期的无性繁殖造成常用作育种亲本的栽培品种遗传背景复杂。本研究选取常见的或用作杂交亲本的不同花色蝴蝶兰5个品种、20个外引品系和33个自育品系作为供试材料,对蝴蝶兰的细胞学、同工酶和RAPD进行研究分析,为蝴蝶兰育种和遗传改良提供参考依据。本论文的主要内容和实验结果如下:
  1.采用酶解去壁法,对蝴蝶兰属(Phalaenopsis)39个品种(系)进行了染色体观察计数和形态分析。结果表明,供试蝴蝶兰的5个品种中有3个四倍体(2n=4x=76),2个三倍体(2n=3x=57);20个外引品系中有15个四倍体,1个三倍体和4个非整倍体;14个自育品系包括10个四倍体、4个非整倍体和1个三倍体。均未见二倍体。不同品种(系)的染色体长度和形态相差较大,存在核型多样性;有22个品种(系)的染色体组全部由小染色体(长度2.5 um左右)组成,17个品种或品系除了含小染色体外还含有大染色体(长度为5~9.5 um),染色体大小组成与花色有一定相关性。
  2.利用酶解法制片,对分裂中期相对较多的供试材料的选取、有效的预处理方法、适宜的酶解时间和温度加以探索。实验结果显示,换盆后14~20d的盆苗嫩根根尖分裂活性最高。剪取长1cm左右的根尖用0.002mol?L-1的8-羟基喹啉在18℃预处理4h,卡诺固定液固定2~24h,再用4%纤维素酶和1%果胶酶的混合酶液在25℃下酶解1.5h能获得高质量的制片,染色体分散良好、形态清晰。将该方法应用于小孢子母细胞减数分裂过程的观察,也得到了减数分裂各发育时期的清晰图象。
  3.对不同倍性蝴蝶兰(Phalaenopsis)品种(系)的减数分裂过程的观察结果表明,3个品种(系)减数分裂过程中的染色体行为有明显差异。4x+2(2n=78)的‘9912-80’中期二价体出现的频率很高,在观察的23个小孢子母细胞中,有5个细胞均为二价体,其余18个细胞的二价体在36~38个之间。后期I同源染色体分离时,染色体落后的细胞所占比例达60%,迟滞染色体的数量为1~3对,但‘9912-80’最终能形成正常的四分体。三倍体‘满天红’(2n=57)的19个大染色体中期I均以单价体的形式出现,小染色体则配对成二价体、四价体。三倍体‘00036-1’的同源染色体在后期I分离紊乱,随机分成几组。2个三倍体品种(系)均未见形成正常四分体。
  4.蝴蝶兰POD同工酶分析采用成熟根为材料,以0.1 mol·L-1 Tris-HCl(pH8.0)缓冲液提取POD同工酶能获得数量多且清晰的酶谱。20个不同花色的蝴蝶兰品种(系)显示了不同的POD同工酶酶谱,聚类结果表明,差异系数大于0.48时可将20不同花色的蝴蝶兰可以分为3大类,白色品种(系)的蝴蝶兰与红色花系和黄色花系具有较近的亲缘关系,而红色和黄色蝴蝶兰亲缘关系较远。分析了6个杂交(自交)的亲子组合,结果有4个组合杂交F1的POD同工酶谱与母本酶谱接近,1个组合的后代酶谱接近父本,自交后代则与亲本的酶谱存在差异,表现出蛋白质水平上的性状分离。
  5.利用RAPD分析技术对蝴蝶兰进行聚类分析。从34条随机引物中筛选到的5个特异引物,确定了12个品种(系)间的遗传距离并构建系统聚类树图,在RAPD聚类树图中,12个品种可以分为3个家族,差异系数最小为0.09,最大为0.39。

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