大鼠臂丛损伤后脊髓运动神经元再生路径及相关蛋白的表达

摘要

背景与目的：
　　臂丛神经损伤(Brachial plexus injury,BPI)是发病率很高的疾病,往往造成上肢功能的缺失,尤其是根性损伤,可致大量的运动神经元死亡。周围神经损伤后虽有较强的再生能力,但神经再生后功能的恢复往往并不理想。神经损伤再生时轴突路径的选择对功能恢复起决定性作用。对股神经模型的研究显示周围神经损伤后再生的运动轴突往往趋向于优先再支配肌支,即优先肌支再支配(preferential motor reinnervation, PMR)。本实验研究:(1)臂丛神经根性损伤后脊髓运动神经元的存活,其再生轴突的路径选择及运动功能的恢复。(2)臂丛神经远端损伤后脊髓运动神经元再生轴突的路径选择及其中热休克蛋白70(Hsp70)、热休克蛋白27(Hsp27)和神经型一氧化氮合酶(nNOS)蛋白的表达变化。
　　材料与方法：
　　1.实验动物成年雄性SD大鼠。
　　2.荧光追踪荧光金逆行标记再生的运动神经元。
　　3.中性红染色复染,以计数存活神经元数。
　　4.grooming实验观察大鼠手术侧前肢的运动,判断BPI后运动功能恢复的情况。
　　5.免疫组织化学染色 SABC法检测脊髓组织切片中Hsp70、Hsp27和nNOS蛋白的表达情况。
　　结果：
　　1.中性红复染
　　臂丛不同根性损伤后大量的脊髓运动神经元死亡。切断、挫伤及撕脱后存活的运动神经元数分别为1126±25,1005±89,881±76,三组间差异均有统计学意义(P<0.05),且三实验组存活神经元数与对照组(1900±39)均有显著性差异(P<0.01)。在挫伤组和切断组中C6节段存活神经元数(494±50,506±36)明显多于C5(311±31,299±21)和C7(200±49,322±34)节段(P<0.01),在撕脱组中C6节段存活神经元数(340±53)与C5(293±34)节段无差别,但明显多于C7(248±24)节段(P<0.01)。而对照组中C7节段神经元(759±36)最多。
　　2.荧光追踪
　　根性损伤时,皮支荧光金逆行标记,各组中均标记到少量的约10~20个神经元,组间均无差别;肌支标记的神经元数:挫伤组(355±75)、撕脱组(300±51)及切断组(272±48)三组间差异无统计学意义(P>0.05),但与对照组(611±40)间差异均有统计学意义(P<0.01)。其中肌支标记神经元数C6节段所占比例各组均大于50％,各损伤组中C5和C7节段所占比例与对照组间差异均有统计学意义(P<0.01)。远端挫伤和切断伤后肌支标记神经元数分别为:533±45,609±21,皮支标记神经元数分别为:18±5,162±45。两种损伤后肌支标记的神经元数均较皮支标记的多(P<0.01)。
　　3.运动功能恢复情况
　　BPI后各鼠均有不同程度的运动功能的恢复。根性伤后,挫伤组(3.42级)明显好于撕脱组(1.75级)及切断组(1.75级)(P<0.01),后两组间差异无统计学意义(P>0.05),但是三实验组均明显差于对照组(5级)(P<0.01);远端伤后,切断组和挫伤组的功能恢复均较明显,且4级以上百分比挫伤组(75%)优于切断组(50%)(P<0.01)。
　　4.免疫组织化学结果
　　与对照组相比,两实验组手术侧脊髓运动神经元中三种蛋白的表达均显著上调(P<0.01)。切断组比挫伤组表达较高水平的Hsp70(143±7,129±5)和Hsp27(145±6,137±3)(P<0.01);而nNOS蛋白在挫伤组中有较高水平的表达(挫伤组:103±4;切断组:67±6)(P<0.01)。
　　结论：
　　(1)臂丛神经损伤后脊髓前角运动神经元再生轴突的路径为肌支路径,损伤的位点与性质对再生轴突路径的选择无影响。
　　(2)臂丛不同根性损伤对脊髓前角运动神经元的存活影响不同,但对其再生无影响。
　　(3)臂丛不同根性损伤后神经重建促进了神经元的存活。
　　(4)臂丛根性损伤后肌皮神经的再生神经元主要来源为C6,C7也参与到重建过程。
　　(5)臂丛不同根性损伤后运动功能的恢复程度不同。
　　(6)臂丛远端不同损伤后脊髓前角运动神经元中Hsp70、Hsp27和nNOS蛋白的表达不同,三者可能促进了损伤后神经元的存活与再生。

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目录

第一章 前言

第二章 实验器材

2.1 实验动物

2.2 主要试剂

2.3 主要器材

2.4 主要试剂的配制方法

第一部分 大鼠臂丛根性损伤后脊髓运动神经元的存活及再生路径选择第三章 实验方法

3.1 实验动物分组

3.2 模型的制备

3.3 观察指标的实验方法

3.4 计数方法

3.5 统计学分析

第四章 实验结果

4.1 前臂外侧皮神经荧光注射组

4.2 中性红染色显示存活神经元数

4.3 肌皮神经肌支标记总神经元数

4.4 肌皮神经肌支标记各节段神经元数所占比例

4.5 运动功能恢复情况

第五章 讨 论

5.1 臂丛根性损伤后脊髓运动神经元的存活

5.2 轴突再生及再生路径

5.3 各节段标记神经元所占的比例

5.4 运动功能的恢复

第二部分 大鼠臂丛远侧损伤后脊髓运动神经元再生路径选择及相关蛋白的表达第六章 实验方法

6.1 实验动物分组

6.2 模型的制备

6.3 观察指标的实验方法

6.4 统计学分析

第七章 实验结果

7.1 C6前、后根撕脱后皮支标记神经元数

7.2 远端损伤后肌支、皮支分别标记的运动神经元数

7.3免疫染色结果

7.3 运动功能恢复情况

第八章 讨论

8.1 远侧损伤后运动神经元的再生路径

8.2 远侧损伤后运动功能的恢复

8.3 远侧损伤后运动神经元中蛋白的表达

第九章 结论

参考文献

附图

综述

致谢