蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12与心脏HERG钾通道相互作用并调控通道功能的研究

摘要

背景:由人类果蝇相关基因――HERG(Humanether-a-go-go-relatedgene)编码的心脏HERG钾通道属于电压依赖性钾通道,介导快速激活延迟整流钾电流(rapidlyactivateddelayedrectifierpotassiumcurrents,Ikr)。HERG钾通道是心脏正常电活动的基础,HERG基因突变及药物阻断该通道后可导致长QT综合征(thelongQTsyndrome,LQTS)。目前已发现10个与LQTS相关基因。其中,HERG突变可以导致第二型的LQTS(LQT2),是LQTS的第二常见原因。而蛋白质-蛋白质相互作用是很多细胞功能的重要基础,信号转导、细胞周期调控、RNA转录、DNA复制、蛋白质翻译、蛋白质翻译后加工及修饰等功能的完成都依赖于蛋白质-蛋白质的相互作用。近年已报道一些蛋白质与HERG钾通道存在相互作用并调控该通道蛋白的表达、转运及功能。本课题组前期研究应用酵母菌双杂交技术初步筛选出与HERG钾通道蛋白氨基末端存在相互作用的15个蛋白质,包括:蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12(Tyrosine-proteinphosphatasenon-receptortype12,PTPN12)、caveolin-1、FHL2、Myotrophin蛋白等,其中的PTPN12可能对HERG钾通道具有重要的调控作用,进一步证明PTPN12与心脏HERG钾通道存在相互作用,并阐明PTPN12对HERG钾通道功能是否存在调控作用,为开发治疗HERG钾通道异常所致心律失常的蛋白质药物奠定基础。
　　目的:鉴定HERG钾通道的相互作用蛋白,研究PTPN12对HERG钾通道功能的调控作用。
　　方法:(1)应用免疫共沉淀技术进一步验证酵母双杂交所筛选蛋白与HERG之间的相互作用:将抗HERG特异性抗体和总蛋白进行混合,再加入ProteinA/GPlus-Agarose进行混合,离心沉淀,将沉淀物进行电泳,随后应用抗PTPN12抗体进行WesternBlot分析。(2)GSTpull-down分析:应用GST-HERGT-NT融合蛋白和谷光苷肽-琼脂糖4B小球从大鼠心肌裂解物中沉淀蛋白质,应用抗PTPN12抗体对沉淀物进行WesternBlot分析;(3)免疫荧光组织化学分析:培养HEK293细胞,应用Lipofectamine2000将pcDNA3.1-PTPN12质粒和pcDNA3.0-HERG质粒共转染HEK293细胞,转染48小时后固定,应用抗PTPN12和抗HERG的抗体和荧光标记二抗显示PTPN12及HERG的亚细胞定位,应用激光共聚焦显微镜观察。(4)应用膜片钳技术,研究PTPN12对HERG钾通道功能的影响。
　　结果:(1)免疫共沉淀分析发现抗HERG的抗体能够沉淀HERG和PTPN12复合物;(2)应用GSTpull-down分析发现GST-HERG-NT能够将PTPN12沉淀,而GST蛋白则不能沉淀PTPN12;(3)免疫荧光组织化学分析:用倒置荧光显微镜观察可见在细胞膜上PTPN12蛋白和HERG蛋白分别发出绿色荧光和红色荧光,二者荧光重叠部分(黄色荧光)提示这两种蛋白在细胞上共定位,发现PTPN12和HERG两个蛋白共定位的地方主要出现在细胞膜。(4)膜片钳检测发现,PTPN12蛋白能降低HERG电流幅度。
　　结论:本实验结果表明蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12(PTPN12)与心脏HERG钾通道的氨基末端存在相互作用,并通过这种相互作用发挥了调控HERG钾通道功能的作用,使HERG钾通道电流振幅降低。本结果提示PTPN12参与了HERG钾通道功能的调控,其机制可能是通过改变HERG钾通道磷酸化程度而发挥作用。这一发现将有助于进一步理解HERG通道功能的调控机制,为更深刻理解LQTS的发病机理及开发治疗LQTS的蛋白质药物提供新的思路。

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前 言

实验材料

2.1主要试剂、试剂盒及抗体

2.2所用主要仪器设备

2.3 菌株

2.4 质粒载体

2.5细胞株

2.6 主要配制试剂

实验方法

3.1重组质粒pcDNA3.1-PTPN12的构建、鉴定

3.2免疫共沉淀

3.3 GST pull-down 分析

3.4免疫荧光组织化学分析

3.5应用膜片钳技术，研究PTPN12对HERG钾通道功能的影响

3.6 统计学分析

实验结果

4.1免疫共沉淀

4.2 GST 融合蛋白的表达

4.3免疫荧光组织化学分析

讨 论

结 论

参考文献

文献综述

参考文献

致谢

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