凡纳滨对虾血蓝蛋白抗肿瘤活性及其功能多样性的糖分子基础研究

摘要

对虾血蓝蛋白是近年来发现的一种与对虾免疫防御有关的多功能蛋白，其具有酚氧化酶活性、抗病毒、抗细菌、凝集、溶血等多种非特异性免疫学活性。然而迄今为止，其是否具有抗肿瘤活性尚不清楚，同时其功能多样性的糖分子基础还有待于进一步深入研究。为此，本研究在探索对虾血蓝蛋白抗肿瘤活性及其分子作用机制的基础之上，对其功能多样性的糖分子基础进行了较深入的研究，所获研究结果具体如下：
　　1、对虾血蓝蛋白抗肿瘤活性及其分子机制研究
　　首先，采用SRB和MTT两种方法探索对虾血蓝蛋白对Hela细胞的抗肿瘤活性。结果发现，10-50μg/mL蓝蛋白处理Hela细胞48h后，血蓝蛋白对Hela细胞的抑制率56.87-71.35％，而对正常的293T细胞无抑制活性，且对肿瘤细胞的抑制活性随着血蓝蛋白浓度的上升，对Hela细胞的抑制率逐渐提高，呈明显的浓度-剂量效应，由此说明，对虾血蓝蛋白具有抗肿瘤活性。
　　继而，采用显微镜观察和Dapi染色技术分析血蓝蛋白对Hela细胞和正常细胞形态和细胞核的影响，结果表明，血蓝蛋白能够使Hela细胞皱缩、变圆并产生类似阳性对照的凋亡小体，而对正常的293T细胞没有影响。提示，血蓝蛋白可能诱导了Hela细胞的凋亡。
　　接着，采用细胞免疫荧光和DNAladder实验技术分析血蓝蛋白与Hela细胞的相互作用以及血蓝蛋白对Hela细胞核基因组的影响，结果发现，血蓝蛋白能够与细胞膜相互结合并（或者）能进入细胞内部，并能使细胞核基因组在100bp和300bp左右产生梯状条带，进一步表明血蓝蛋白可能诱导了Hela细胞的凋亡。
　　然后，我们采用蛋白质组学的策略鉴定对虾血蓝蛋白作用Hela细胞后主要变化蛋白。结果显示，与对照组相比，17个蛋白点表达水平发生明显的变化，其中11个蛋白表达上调，6个蛋白表达下调，经MALDI-TOF-TOF/MS分析和Mascot搜索,蛋白点1、3、4、5、8、11、13、15、16、17等10个显著差异的蛋白点分别鉴定为Edar相关死亡受体、Hsp60变体、Hsp70前体、YWHAZ蛋白和GTP结合蛋白Ran等蛋白点，说明这些蛋白可能与Hela细胞凋亡密切相关。
　　最后，我们随机挑选Hsp60，Hsp70前体，14-3-3蛋白ζ/δ，Hsp90，GTP结合蛋白Ran等5个蛋白采用荧光定量-PCR的方法，分析它们在转录水平上的变化。结果表明，mRNA和蛋白水平的表达基本一致，与对照组相比，Hsp70前体，14-3-3蛋白ζ/δ，Hsp90，GTP四个蛋白在mRNA水平上的表达具有显著性差异。
　　结合上述质谱的结果以及国内外相关研究进展，我们推测血蓝蛋白抑制Hela细胞生长的机制可能为：对虾血蓝蛋白以某种方式进入Hela细胞内部后，通过产生活性氧或醌类物质诱导肿瘤细胞以细胞程序性凋亡或细胞自噬凋亡机制抑制肿瘤细胞生长。
　　2、对虾血蓝蛋白糖分子基础的研究
　　首先，采用亲和层析、凝集素层析的方法纯化对虾血蓝蛋白：HMC-C、HMC-NC。糖含量显示，HMC-C、HMC-NC糖含量分别为3.19％.和0.15％，前者为后者的22倍；糖印迹结果表明，与HMC-NC相比，HMC-C是高甘露糖（葡萄糖）基化程度较高。HPLC分析发现，胰酶消化后HMC-C、HMC-NC在HPLC图谱分别表现为54、42个峰，尤其是两者胰酶水解的肽段再次经ConA凝集素柱纯化，前者在HPLC图谱上表现为49个峰，而后者仅为6个峰。由此说明，凝集素层析分离纯化所得的两种血蓝蛋白在糖基修饰方面存在较大差异。
　　继而，对采用玻片凝集技术对该两种血蓝蛋白的免疫学功能进行对比分析。结果显示，HMC-C在溶藻酸弧菌和河弧菌凝集活性、鸡血细胞和人细胞的细胞凝血活性以及对鸡血细胞溶血活性上均明显强于HMC-NC，其中，对溶藻弧菌的凝集活性前者为后者的8倍；对鸡红细胞的凝血活性HMC-C为HMC-NC的4倍。结合本课题组最近发现的5种糖含量不同的对虾血蓝蛋白的功能对比分析的结果，我们推测血蓝蛋白发挥多种免疫学功能应该与其糖基修饰有关，即血蓝蛋白的糖基化修饰可能是其功能多样性的分子基础之一。
　　综上所述，对虾血蓝蛋白同样具有抗肿瘤活性，糖基化修饰可能为其功能多样性的分子基础之一。所获研究结果为彻底揭示血蓝蛋白的免疫学活性及其功能多样性的糖分子作用基础奠定了良好的基础，并对血蓝蛋白潜在的临床应用前景提供了较好的科学依据。

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第一章 前言

1.1血蓝蛋白简介

1.2血蓝蛋白免疫学功能研究进展

1.3 对虾血蓝蛋白功能多样性分子基础研究进展

1.4 本论文研究的目的与意义

第二章 对虾血蓝蛋白抗肿瘤活性及其作用机制的探索

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三章 对虾血蓝蛋白功能多样性的糖分子基础研究

3.1 实验材料与试剂

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

参考文献

结论与创新

学术交流及论文撰写情况

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