凡纳滨对虾血蓝蛋白及其功能性肽段抗肿瘤活性的研究

摘要

血蓝蛋白(hemocyanin，HMC)是位于节肢动物（螯肢类、甲壳类、多足类和蜘蛛类）和软体动物（腹足类和头足类）血淋巴中的含铜呼吸蛋白。一般认为，血蓝蛋白的主要生物学功能与机体内的输氧有关，有意思的是，近年来学者们发现软体动物血蓝蛋白还具有抗肿瘤活性。然而，迄今为止，对虾血蓝蛋白及其功能性肽段是否具有抗肿瘤活性尚不清楚。为此，本研究以凡纳滨对虾血蓝蛋白及其小分子合成肽（HMC-P）为研究对象，在课题组已有研究基础之上，进一步采用细胞生物学、分子免疫学、实验动物学和蛋白质组学等策略对其进行了较为深入的研究，所获主要研究结果如下：
　　1、对虾血蓝蛋白抗肿瘤活性
　　1）体外水平
　　课题组前期采用Sulfordmaine B(SRB)、DNA ladder、蛋白质组学和荧光定量PCR等技术发现对虾血蓝蛋白对HeLa细胞有较强的增殖抑制和潜在促凋亡作用。在此基础之上，本论文进一步检测血蓝蛋白刺激HeLa细胞后其内部活性氧（ROS）、线粒体膜电位以及Caspase-3/9酶活性等的变化情况。结果表明，20-100μg/mL（Caspase-3/9酶活性检测：20-60μg/mL）血蓝蛋白与HeLa细胞共培养24 h后，HeLa细胞可发生明显的ROS爆发现象，线粒体膜电位显著降低，Caspase-3/9的酶活性明显上升，与阴性对照相比，均存在显著性（p<0.05）或极显著性差异（p<0.01）。由此推测，对虾血蓝蛋白体外抗肿瘤活性的作用机制可能为线粒体介导的程序性凋亡机制。
　　2）体内水平
　　在上述研究基础之上，进一步以S180荷瘤小鼠为肿瘤模型，采用腹腔注射的方法探索血蓝蛋白体内抗肿瘤活性情况。结果发现，2-6 mg/kgbw/d剂量血蓝蛋白处理荷瘤小鼠8天后，S180实体瘤的生长得以明显的抑制，其中中剂量组（4mg/kgbw/d）抑瘤率为49％，与模型组和对照组（BSA）相比，其抑瘤率、瘤体积、肝指数、脾指数等均存在显著性差异（p<0.05）或极显著性差异（p<0.01）。
　　生化指标结果显示，实验组血清和肝脏中的超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量显著上升或下降，其中，血蓝蛋白中剂量组（肝脏MDA除外）与模型组和对照组（BSA）相比，存在极显著性差异（p<0.01）。
　　非特异性免疫功能分析发现，血蓝蛋白各剂量组均可以显著提高小鼠血清中的TNF-α水平、NK细胞杀伤活性和脾淋巴细胞的增殖能力，与模型组和对照组（BSA）相比，均存在显著性差异（p<0.05）或极显著性差异（p<0.01）。
　　HE切片病理组织学分析表明，与模型组和对照组（BSA）相比，实验组肿瘤细胞排列松散、细胞变圆变小、肿瘤组织出现较大面积坏死灶和纤维化组织结构。
　　这些研究结果说明，血蓝蛋白不仅对S180荷瘤小鼠具有明显抗肿瘤活性，而且对机体还有一定的保护效果。
　　2、对虾血蓝蛋白功能性肽段抗肿瘤活性
　　基于课题组前期发现12种对虾血蓝蛋白功能性肽段（命名为HMC-P）对6种病原菌具有抑菌活性的研究结果，本研究进一步采用SRB、DNA Ladder、DAPI染色、Annexin V-FITC/PI双荧光染色等技术对其抗肿瘤活性进行了初步的研究。结果发现，3种（B10、B11和S7）HMC-P（50μg/ml）分别对HeLa、EC109细胞的生长具有明显的抑制活性，其抑制率为40%-53%；该3种HMC-P处理HeLa细胞24h后，可使细胞产生明显的DNA片段化，同时可导致细胞变圆、皱缩、形成核小体，并出现细胞膜外翻现象。由此说明，对虾血蓝蛋白功能性肽段应该同样具有抗肿瘤活性。
　　综上所述，对虾血蓝蛋白及其功能性肽段对肿瘤细胞（HeLa或EC109）或 S180荷瘤小鼠具有明显的抗肿瘤活性，其作用机制可能与其促进肿瘤细胞的凋亡有关。所获研究结果为揭示对虾血蓝蛋白及其功能性肽段抗肿瘤活性的作用机制奠定了良好的基础。同时，为血蓝蛋白潜在的临床应用以及抗肿瘤药物的筛选提供了新的思路。

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缩略词

第1章 前言

1.1 海洋活性物质抗肿瘤活性及其作用机制研究进展

1.1.1 糖蛋白质

1.1.2多糖及其衍生物

1.1.3活性肽

1.1.4生物碱

1.2 血蓝蛋白免疫学功能及其抗肿瘤活性研究进展

1.2.1血蓝蛋白免疫学功能研究进展

1.2.2血蓝蛋白抗肿瘤活性研究进展

1.3本论文研究的目的与意义

第2章 对虾血蓝蛋白抗肿瘤活性及其作用机制

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物与细胞

2.1.2 主要试剂

2.1.3 溶液配置

2.1.4 主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1 对虾血蓝蛋白的纯化

2.2.2 SDS-PAGE和 Western-blotting 分析

2.2.3 对虾血蓝蛋白体外抗肿瘤活性作用机制分析

2.2.4 对虾血蓝蛋白体内抗肿瘤活性及其作用机制分析

2.3结果与分析

2.3.1 对虾血蓝蛋白体外抗肿瘤活性机制分析

2.3.2 对虾血蓝蛋白体内免疫学活性及作用机制

2.4讨论

2.4.1 凡纳滨对虾血蓝蛋白体外抗肿瘤作用机制

2.4.2 凡纳滨对虾血蓝蛋白体内抗肿瘤活性与作用机制

第3章 对虾血蓝蛋白功能性肽段抗肿瘤活性的初步研究

3.1 实验材料

3.1.1 实验材料

3.1.2 主要试剂

3.1.3溶液配置

3.1.4 主要仪器

3.2 实验方法

3.2.1 HeLa细胞与EC109细胞的复苏、传代、保种

3.2.2 HMC-P蛋白质二级结构分析

3.2.3 Sulfordmaine B (SRB)法筛选血蓝蛋白抑瘤肽（HMC-P）

3.2.4 三种HMC-P对HeLa细胞形态的影响

3.2.5 三种HMC-P对HeLa细胞核影响分析

3.2.6 Annexin V-FITC/PI双荧光染色分析HeLa细胞凋亡情况

3.3 结果与分析

3.3.1 HMC-P的抗肿瘤活性结构预测

3.3.2 SRB法分析HMC-P对HeLa、EC109细胞的生长抑制情况

3.3.3 三种HMC-P对HeLa细胞形态的影响

3.3.4三种HMC-P对HeLa细胞核的影响分析

3.3.5 Annexin V-FITC/PI双荧光染色分析HeLa细胞的凋亡

3.4 讨论

总结与展望

总结

展望

参考文献

论文撰写与学术交流

致谢