黄连素的提纯及其对三种水产动物类致病菌的抑菌特性研究

摘要

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）以及嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）为水产养殖业常见的病原菌，近年来由其引发的细菌性疾病不仅给养殖业带来了巨大的经济损失，还威胁着人类的健康。本实验以黄连为材料，研究黄连素的最佳提纯工艺以及其对三种病原菌的抑菌作用，同时探讨黄连素的抑菌机制，为黄连素在细菌性疾病防治中的应用提供依据，也利于进一步深究黄连素的抑菌机理。
　　利用传统回流、微波、超声等6种方法提取黄连素，并用沉淀法与大孔树脂法纯化，TLC、HPLC测定，结果表明80％乙醇，料液比1：20，T=90℃，t=90min回流提取2次黄连素得率为8.3%，经大孔树脂-沉淀法纯化、HPLC测定，黄连素纯度为86.25%。
　　测定黄连素对三种供试菌MIC、MBC，并运用电镜扫描黄连素对供试菌的作用情况，结果发现，黄连素对三种副溶血弧菌、溶藻弧菌有着强烈的抑制效果，其MIC(Minimal inhibitory Concentration)、MBC(Minimal Bactericidal Concentration)值分别为：0.391g/L、0.391g/L；0.391g/L、0.781g/L；对嗜水气单胞菌的抑制作用相对较弱，MIC、MBC分别为：0.781g/L、1.563g/L。电镜观察发现，黄连素作用下的供试菌菌体黏连、破碎、内容物流出等，明显非正常死亡，且黄连素对菌体的破坏程度随着黄连素浓度增加而增加。
　　抑菌圈法测定黄连素对革兰氏阳性菌与阴性菌的作用差异，氧电极法测定不同浓度黄连素对三种供试菌的呼吸作用影响，并据吸光值绘制黄连素作用下供试菌一步生长曲线，SDS-PAGE观察黄连素对供试菌蛋白表达的影响，以黄连素代替EB核酸进行核酸电泳。结果表明，黄连素作用下：
　　①革兰氏阳性菌与阴性菌的抑菌圈无明显差异；
　　②三种供试菌单位时间内耗氧量微有降低但无明显规律；
　　③供试菌潜伏期延长2h至4h不等，但延长后部分菌体仍存在对数期；
　　④蛋白浓度降低，且电泳显示部分条带未表达；
　　⑤黄连素可以像EB一样插入到DNA中。
　　综上，本文对黄连素的提取及其对水产动物类致病菌的作用进行了较为系统的研究，不仅获得了黄连素的最佳提取工艺，还发现其对副溶血弧菌、溶藻弧菌以及气单胞菌有着良好的抑菌效果，可以应用于水产养殖业细菌性疾病的防治中，抑菌机制方面，黄连素在细菌潜伏期与活跃的DNA发生结合形成了某种复合物，从而抑制了细菌正常的分裂增殖。

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第一章 前言

1 研究背景

2 本试验研究目的及意义

参考文献

第二章 黄连素的提取工艺及其优化研究

1 实验材料

2 实验方法

3结果

4 讨论

参考文献

第三章 黄连素对供试菌的抑制效果研究

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第四章 黄连素对供试菌的抑菌抑制研究

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献