酶法制备牡蛎活性肽及其诱导Hela细胞凋亡的研究

摘要

目的：酶法制备牡蛎活性肽并探讨其诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的作用及机制。
　　方法：
　　（1）采用响应面法优化了复合酶水解牡蛎蛋白的工艺。
　　（2）在温度45℃、pH8.0的条件下，通过探讨底物浓度及酶浓度对水解度的影响，建立酶解牡蛎蛋白的动力学模型。
　　（3）采用Sephadex G-25柱层析法对酶解液中的牡蛎活性肽进行分离纯化，并通过Trcince-SDS-PAGE电泳和凝胶过滤层析法测定其相对分子质量大小。
　　（4）以SRB（Sulfordmaine B磺基罗丹明B）比色法，台盼蓝计数法，Hochest/PI双荧光染色法和DNA Ladder等技术方法检测BPO（Bioactive peptides of oyster）诱导Hela细胞凋亡的方式，并采用流式细胞术和实时定量PCR（RT-PCR）从分子水平上分析了BPO诱导Hela细胞凋亡的作用机制。
　　结果：
　　（1）牡蛎蛋白的最佳酶解工艺为：温度45℃、复合酶浓度2g/L、底物浓度15.3g/L、复合酶比（风味蛋白酶与胰蛋白酶活力比）为2.3：1；
　　（2）复合蛋白酶在温度45℃、pH8.0的条件下，水解牡蛎蛋白的动力学方程及参数为：水解速率模型R=（40.301E0-0.4257S0）exp（-0.2176DH）和水解度动力学模型DH=4.5956ln[1+（8.7695E0/S0-0.09263）t]，动力学失活常数Kd=8.5378min-1和米氏常数Km=3.741mg/mL；
　　（3）纯化得到牡蛎活性肽BPO，并测得其相对分子质量为751Da；
　　（4）BPO能有效抑制体外培养的Hela细胞增殖，并具有浓度与时间依赖性；BPO可阻止Hela细胞G1期向S期的转化；BPO能促进caspase-3mRNA和caspase-10mRNA表达上调。
　　结论：BPO能诱导Hela细胞凋亡，其作用机制与诱导凋亡基因表达上调和细胞周期阻滞有关。

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前 言

1 引言

2 牡蛎的开发与利用

3 酶法制备牡蛎活性肽研究进展

4 酶解动力学研究

5 海洋抗肿瘤活性物质的作用机理

6 本课题的研究内容、意义与创新点

第一章 响应面法优化牡蛎活性肽的酶解制备工艺

1 材料、试剂和设备

2 研究方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

第二章 复合酶水解牡蛎蛋白的动力学研究

1 材料、试剂及仪器

2 研究方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

第三章 牡蛎活性肽的分离与鉴定

1 试剂与仪器

2 实验方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

第四章 BPO诱导Hela细胞凋亡的研究

1 材料、试剂及仪器

2 实验方法

3 实验结果与分析

4 讨论

5 结论

总结与展望

1 结论

2 展望

参考文献

致谢