同型半胱氨酸通过人端粒酶逆转录酶DNA去甲基化加速内皮衰老

摘要

端粒(telomere)是由DNA重复序列和结合蛋白组成的复合物结构,位于真核生物染色体末端。它对于细胞增殖过程中基因组的完整性以及染色体末端稳定性发挥着至关重要的作用。越来越多的研究发现,端粒DNA长度以及其结构的维持与细胞衰老密切相关。已有研究报道与年龄相关的血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)的衰老和功能障碍在人类动脉粥样硬化引起的疾病中发挥重要作用。高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)是动脉粥样硬化的一个独立危险因子。内皮功能紊乱在同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)相关的动脉粥样硬化发生发展中发挥重要作用,其中内质网应激、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和表观遗传学调控等参与了此过程。研究显示,Hcy可加速内皮祖细胞或内皮细胞衰老,从而引起细胞功能障碍,然而,其作用机制尚不明确。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因可以通过调控端粒酶的活性以维持端粒的长度和功能。因此,改变hTERT的表达可影响端粒的长度,进而影响细胞的增殖和寿命。有研究报道,DNA去甲基化可使肿瘤细胞中的hTERT基因表达下降,端粒酶活性降低甚至失活和端粒长度缩短,提示hTERT基因的表观遗传学修饰在癌变过程中起重要作用。我们之前的研究在体内体外发现Hcy通过表观遗传学调控动脉粥样硬化基因,从而引起内皮功能紊乱,这促使我们考虑到Hcy是否通过通过表观遗传学修饰hTERT的表达,进而影响人血管内皮的衰老过程。本课题的目的在于探讨Hcy对血管内皮中hTERT表达的调节机制及其意义,以期进一步揭示Hcy导致心血管疾病发生、发展的分子机制,为临床防治心血管疾病提供新的思路。
　　首先,我们将P2-P10代人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分别放在正常内皮细胞培养基(Endothelial cell medium,ECM)和含病理生理浓度状态下Hcy(25μmol/L)的ECM中持续培养,采用定量PCR法检测细胞衰老标志物P16和P21,以及代表端粒长度改变的端粒与单拷贝基因的比值(T/S比值)。结果发现正常ECM培养的HUVECs中,P16和P21mRNA的表达水平在培养P8代开始明显增加,端粒长度则在P10代开始缩短。然而,Hcy持续刺激的HUVECs的上述基因表达的增加和端粒长度的缩短,均较正常ECM培养时提前2代。我们应用β-半乳糖苷酶染色检测发现从P6代开始,Hcy导致的细胞衰老比例增加。随后,采用实时定量RT-PCR和蛋白印迹法检测hTERT的表达情况,发现Hcy在mRNA和蛋白水平均下调hTERT的表达。而应用可逆转Hcy导致的DNA低甲基化的叶酸(100μmol/L)处理HUVECs后,可以在一定程度上抑制Hcy引起的P21的上调,T/S和hTERT的下降,并降低了衰老细胞的比例,说明DNA甲基化可能参与了Hcy加快内皮衰老的过程。为了进一步研究hTERT表达下降的机制,我们采用亚硫酸盐测序技术,检测hTERT基因启动子区甲基化水平,发现hTERT基因启动子区CTCF(hTERT抑制性结合蛋白)结合位点存在DNA甲基化修饰,Hcy的处理可以使该位点发生去甲基化反应,降低该位点的甲基化程度,从而促进CTCF结合到hTERT启动子,并抑制其转录活性,降低hTERT的表达。
　　结论:我们的研究发现,Hcy可通过DNA去甲基化机制增加hTERT抑制性作用蛋白CTCF结合到hTERT启动子区,下调hTERT的表达,降低端粒酶活性,缩短端粒长度,进而加快血管内皮的衰老过程;通过上调hTERT的表达,可维持端粒长度,对Hcy引起的心血管疾病起保护作用。

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第一章 前 言

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 结 果

3.1 Hcy加速人血管内皮细胞的衰老

3.2 Hcy缩短端粒长度，降低hTERT的表达

3.3 DNA高甲基化抑制同型半胱氨酸产生的内皮衰老

3.4 Hcy增加CTCF并干扰SP1结合到去甲基化的hTERT基因启动子

第四章 讨 论

4.1 Hcy通过缩短端粒长度，促进内皮衰老

4.2 hTERT参与了Hcy诱导的内皮衰老

4.3 Hcy通过DNA去甲基化下调hTERT的表达

第五章 结 论

参考文献

综述

一、 自噬的定义和功能

二、自噬的分子机制

三、动脉粥样硬化中的自噬

四、自噬在动脉粥样硬化中的作用

五、结语

参考文献

致谢

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