碘化N-正丁基氟哌啶醇对小鼠CCl4肝纤维化及人肝星状细胞LX-2的作用研究

摘要

肝纤维化是一类严重危害人类健康的世界性疾病，它是多种慢性肝病共同的病理改变，是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段，后期可发展为肝功能衰竭及肝癌。肝纤维化表现为Ⅰ型胶原的过度沉积，Ⅰ型胶原主要由活化的肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）产生。因此，HSCs的活化和增殖是肝纤维化的核心环节。
　　肝损伤过程中，HSCs活化并发生表型转化成为肌成纤维细胞样细胞，特异性的表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle ation，α-SMA）。促纤维化因子能够促进活化的HSCs合成大量的胶原。转化生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）能够引起肝细胞凋亡，促进HSCs活化和炎性细胞的聚集，是最有力的促纤维化因子。活化的HSCs自身可分泌TGF-β1，加剧肝损伤，促进肝纤维化的发展。
　　碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide，F2）是本实验室设计合成的专利化合物。前期研究发现，F2具有Ca2+通道阻断作用和良好的抗血管平滑肌细胞增殖作用，这提示是否F2对于HSCs的异常增殖活化也有抑制作用。因此，我们采用经典的四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）诱导小鼠肝纤维化模型，研究F2抗肝纤维化的活性，并探讨其作用机制。
　　方法：
　　第一部分：F2抗CCl4诱导的KM小鼠肝纤维化作用
　　1.建立CCl4诱导的KM小鼠肝纤维化模型。
　　2.全自动生化分析仪检测小鼠血清中谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。
　　3. HE及Masson染色观察肝脏纤维化的情况。
　　4.免疫组化、Western-blot法检测小鼠肝脏中α-SMA的表达情况。
　　5．Real-Time PCR检测小鼠肝脏组织中α-SMA、TGF-β1、collagen type I、基质金属蛋白酶2（metrix metalloproteinase2，MMP-2）、基质金属蛋白酶抑制剂1（tissue inhibitors of metalloproteinases1，TIMP-1）、基质金属蛋白酶抑制剂2（tissue inhibitors of metalloproteinases2，TIMP-2）、血小板衍生生长因子BB（platelet derived growth factor BB，PDGF-BB）mRNA的变化。
　　第二部分：F2对人肝脏星状细胞LX-2活化的抑制作用
　　1.20％FBS刺激LX-2细胞48h，建立LX-2细胞活化模型。
　　2. Real-Time PCR检测LX-2细胞α-SMA、collagen type I、MMP-2、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的变化。
　　3. Western-blot检测LX-2细胞TGF-β1、α-SMA、Smad2/3、磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）的表达。
　　结果：
　　第一部分：F2抗CCl4诱导的KM小鼠肝纤维化作用
　　1．F2减轻CCl4诱导的肝损伤，减少胶原沉积。
　　2．F2能够剂量依赖地降低小鼠肝脏组织collagen type I、α-SMA、TIMP-2、MMP-2、TGF-β1、PDGF-BB mRNA水平及α-SMA蛋白表达。
　　第二部分：F2对人肝脏星状细胞LX-2活化的抑制作用
　　1．F2能够量效依赖的降低LX-2细胞α-SMA、collagen type I、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA水平
　　2. F2能够降低LX-2细胞TGF-β1、α-SMA、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表达。
　　结论：
　　1. F2能够抑制星状细胞活化，改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化。
　　2. F2可能通过调节TGF-β/Smad信号通路抑制LX-2细胞的活化。

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第一章 前言

第二章 F2抗CCl4诱导的KM小鼠肝纤维化作用

1 材料与方法

2 主要试剂

3 实验结果

4 小结

第三章F2对人肝脏星状细胞LX-2活化的抑制作用

1 材料与方法

2 实验结果

3 小结

第四章 讨 论

1 MMP-2与TIMP-2

2 TGF-β/Smad 信号转导通路与HSCs

3 展望

第五章 结论

参考文献

论文综述: 肝纤维化的发病机制与肝星状细胞在病程中的作用

个人简历

附录

致谢