复合海藻多糖及其诱导HeLa细胞凋亡机理研究

摘要

海藻多糖具有多种生理活性，如抗肿瘤、抗氧化、机体免疫调节等，且毒副作用小，已成为海洋天然产物研究的热点之一。研究发现复合多糖药理作用呈现协同性，目前食用菌和中草药复合多糖研究报道较多，其中食用菌类复合多糖作为广谱的免疫促进剂和肿瘤辅助治疗药物已得到广泛的应用，然而对于复合海藻多糖的研究鲜有报道。因此，本文选取三种资源丰富的海藻：坛紫菜（Porphyra haitanensis）、螺旋藻（Spirulina platensis）、海带（Laminaria japonica），分别采用双水相萃取分离新技术和木瓜蛋白酶法代替传统的乙醇沉淀和TCA、Sevage除蛋白等方法制备高活性紫菜、螺旋藻多糖和海带多糖，进而研究复合海藻多糖及其对肿瘤HeLa细胞生长抑制的增效作用和作用机制。
　　研究结果如下：
　　(1)乙醇-硫酸铵双水相萃取紫菜多糖体系优化
　　采用浊点滴定法绘制乙醇-硫酸铵双水相相图，根据相图选取5个不同系线长度（TLL）的体系进行优化，以多糖回收率为主要指标同时考察蛋白的分配情况，得最优体系为：TLL=40（乙醇质量分数27％、硫酸铵质量分数18%），此时，多糖回收率Y达79.8%，分配系数K为0.23。
　　(2)海藻多糖制备及结构初步分析
　　采用不同的乙醇-硫酸铵双水相优化体系分别萃取紫菜、螺旋藻多糖，待分相后取下相，置于4℃冰箱结晶除去大部分硫酸铵，上清经透析得透析液；通过水提、脱胶、除褐藻酸、乙醇沉淀制备海带粗多糖，采用木瓜蛋白酶法除蛋白，醇沉水溶后经透析得透析液；各多糖透析液分别经浓缩、真空冷冻干燥得三种海藻多糖样品，其多糖含量均达90%以上。红外光谱分析表明三种样品均为多糖类物质，其中紫菜、海带多糖含有硫酸基，而螺旋藻多糖未见有硫酸基特征吸收峰，其为α-糖苷键连接。1H-NMR分析表明紫菜多糖含有α、β型异头碳，而螺旋藻、海带多糖异头碳为β构型。
　　(3)复合海藻多糖配比优化及其对HeLa细胞的作用
　　采用SRB法分别检测紫菜多糖（PPH）、螺旋藻多糖（PSP）、海带多糖（PLJ）及其不同配比构成的复合多糖对HeLa细胞生长抑制情况，通过正交实验筛选出三种多糖最适配比PPH：PSP：PLJ为3：5：7，由此配比组合成复合海藻多糖（APC）。实验表明，APC对HeLa细胞生长具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性，IC50值为374.45μg/mL；当浓度为600μg/mL，作用48h后，对HeLa细胞生长抑制率高达69.70%，明显高于三种单味多糖中的最高抑制率（52.76%）。通过细胞形态观察发现APC能显著抑制HeLa细胞生长，使细胞呈现明显的凋亡特征，随着剂量和处理时间的增加，凋亡或坏死的细胞数目增多；Annexin-V/PI双染色法分析证实APC能诱导HeLa细胞凋亡或坏死，且具有剂量依赖关系。
　　(4) APC诱导HeLa细胞凋亡途径探究
　　JC-1染色分析表明APC处理组HeLa细胞线粒体膜电位显著降低，且呈剂量依赖性。不同剂量的APC处理HeLa细胞48h后，细胞Caspase-9、Caspase-3酶活力均增强，与对照相比，差异极显著（P<0.01）。APC可降低HeLa细胞线粒体膜电位，提高Caspase-9、Caspase-3酶活力，诱导其凋亡或坏死，推测其抗肿瘤作用可能与线粒体介导的细胞凋亡有关。
　　结果表明：三种海藻多糖复合，对 HeLa细胞抑制作用明显增强，显示出较强的抗肿瘤活性；APC可通过线粒体介导的途径诱导HeLa细胞凋亡或坏死。本研究结果可为海藻多糖抗肿瘤功能食品或药物的进一步研究提供可靠的实验基础和依据，具有重要的理论和实际意义。

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第一章 前 言

1.1 海藻多糖生物活性研究进展

1.2 复合多糖抗肿瘤研究进展

1.3 细胞凋亡

1.4 双水相萃取技术研究进展

1.5 本文研究目的及意义

1.6 本文研究内容

1.7 技术路线

第二章 海藻多糖的制备及结构初步分析

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 数据处理与分析

2.4 结果与分析

2.5 讨论

第三章 复合海藻多糖配比优化及其体外抗肿瘤活性研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 数据处理与分析

3.4 结果与分析

3.5 讨论

第四章 复合海藻多糖诱导HeLa细胞凋亡途径

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 数据处理与分析

4.4 结果与分析

4.5 讨论

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

致谢

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