多孔菌抗肿瘤活性评价及巨多孔菌有效成分分离、结构鉴定及诱导HeLa细胞凋亡的分子机理研究

摘要

多孔菌是属于担子菌亚门的一类大型真菌，它们与子囊菌亚门的一些种共同构成了高等真菌药用活性物质的主要来源。为了开发利用我国的多孔菌资源，本论文对多孔菌进行了以下研究： 1、对浙江、湖南两省的药用多孔菌资源进行了调查、采集、鉴定，并采用MTT法详细评价了35种多孔菌对人宫颈癌细胞株HeLa及人肝癌细胞株SMMC-7721的体外抗肿瘤活性。结果表明，所有参试材料的甲醇和水提取物均未显示细胞毒性(IC<,50>>100μg/ml)，但有21种多孔菌子实体的石油醚和乙酸乙酯提取物显示了不同强度的体外抗肿瘤活性(34<50μg/ml)。选定活性最强的巨多孔菌(IC<,50>=34.2μg/ml)作为进一步研究的对象。 2、研究了巨多孔菌的生物学特性。结果显示，巨多孔菌实体的发生对土壤肥力要求不高，但是与降雨关系密切；适宜子实体生长的土壤湿度为40％-60％，光照以散射光为宜。对巨多孔菌生物学特性的了解有助于我们对该种进行引种和驯化。 3、用活性跟踪分离的方法，对巨多孔菌乙酸乙酯提取物的化学成分进行了有目的分离，得到一个具较强细胞毒活性的单体clitocine；另外，还鉴定了clitocine的一个无活性构象异构体α-clitocine。本研究首次报道的clitocine是巨多孔菌中的主要细胞毒活性物质。a-clitocine首次以天然产物的形式被报道。 4、评价了clitocine的体内、外抗肿瘤活性。结果表明，clitocine对体外培养的人宫颈癌细胞Hela、人肝癌SMMC-7721、人乳腺癌Bcap-37和MCF-7、人胃癌细胞株SGC-7901均有增殖抑制作用，并具有一定选择性，对SMMC-7721的抑制作用最强(IC<,50?=1.1μM)，对MCF-7的作用较弱(IC<,50>=43.0μM)。小鼠体内抗肿瘤实验显示，clitocine对小鼠S180肉瘤没有显著抑制作用。首次发现clitocine对小鼠天然免疫器官一脾脏具有强烈的抑制作用。 5、首次探讨了clitocine诱导人宫颈癌细胞HeIa死亡的作用机理，获得了一些有意义的发现。151xM clitocine作用HeLa细胞诱导了时间依赖的凋亡；Clitocine诱导的细胞死亡具有典型的凋亡特征，如核形态的变化，DNA片断的产生，caspase的激活，PARP裂解，细胞色素c释放等；Clitocine处理激活了caspase-3、8、9，在48h内caspase家族抑制剂(Z-VAD-FMK)，caspase-3抑制剂(Z-DEVD-FMK)，caspase-9 inhibitor(Z-LEHD-FMK)均可显著抑制clitocine诱导的死亡；Clitocine可明显上调促凋亡蛋白Bax的表达，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。研究还表明clitocine诱导的HeLa细胞死亡发生在细胞周期各个时期，对周期无阻滞作用。因此，初步认为，clitocine诱导的细胞死亡是由caspase家族和Bcl-2家族共同调控，对细胞周期循环无阻滞作用的细胞凋亡过程的结果。

目录

声明

摘 要

第一章 绪论

1多孔菌抗肿瘤活性物质的研究进展

1.1 寄主介导的抗肿瘤大分子物质

1.2 细胞毒性抗肿瘤小分子

2天然药物的抗肿瘤研究现状

2.1 肿瘤研究概况

2.2 天然药物在肿瘤治疗中的应用

2.3 天然药物的抗肿瘤作用机制

3天然药物诱导细胞凋亡及其分子机制

3.1 细胞凋亡的概念及其形态、生化特点

3.2 细胞凋亡的分子机制

4本研究的内容、目的和意义

参考文献

第二章 35种多孔菌体抗癌活性评价

1材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2结果与分析

2.1 多孔菌的生境、采集、鉴定及药用调查

2.2 35种多孔菌的体外抗肿瘤活性初步筛选

2.3 35种多孔菌的体外抗肿瘤活性复筛

3讨论

4 小结

参考文献

第三章 巨多孔菌的物种生物学特性研究

1材料和方法

1.1 调查时间及地点

1.2 野外调查参数

1.3 土壤分析方法

2结果与分析

2.1 生境

2.2 土壤

2.3 光照

2.4 湿度

3讨论与结论

参考文献

第四章 巨多孔菌抗肿瘤活性成分的活性跟踪分离及结构鉴定

1结构鉴定

2实验部分

2.1 主要仪器

2.2 分离填料和溶剂

2.3 试验材料

2.4 提取与分离

2.5 活性测试

2.6 理化及光谱数据

参考文献

第五章 CLITOCINE的抗肿瘤活性评价

1材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2结果与分析

2.1 Clitocine对离体培养的人肿瘤细胞的增殖抑制作用

2.2 Clitocine对小鼠荷瘤S180的抑制效果

3讨论

4 小结

参考文献

第六章 CLITOCINE诱导HELA细胞死亡的分子机理研究

1材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2结果与分析

2.1 Clitocine诱导HeLa细胞死亡与剂量和时间关系

2.2 凋亡细胞的形态学观察

2.3 凋亡细胞的细胞流式术分析

2.4 Clitocine诱导的DNA片断化

2.5 Caspase家族抑制剂对clitocine诱导的DNA片断化的影响

2.6 Caspase家族成员的活性

2.7 Caspase抑制剂对clitocine诱导的细胞死亡的影响

2.8 PARP裂解

2.9 Clitocine诱导的细胞色素C(Cyt-c)的释放

2.10 Bcl-2/Bax在凋亡调控中的作用

3讨论

3.1 Clitocine诱导HeLa细胞凋亡的特征

3.2 Clitocine诱导HeLa凋亡的分子机制

4 小结

参考文献

全文结论

博士期间发表或拟发表的论文

致 谢