潮汕食管癌变过程中BCL-6基因扩增的研究

摘要

背景和目的：食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一。广东省潮汕地区是中国食管癌发病带之一。虽然治疗水平在近年来已经有长足进展，但是食管癌患者的5年生存率未见明显提高。因此，加强对食管癌发病及演进机制的研究，提高早期食管癌的诊断率，改善其预后有重要的意义。本课题组早期采用比较基因组杂交技术（CGH），对三株 ESCC细胞系进行全基因组拷贝数变异（CNVs）筛查，发现其中KYSE30、H5E973两株细胞系均存在染色体3q26.3-qtel基因组扩增现象。随后在中国医学科学院关于食管癌和癌旁石蜡组织的遗传分析检测报道中提及，3号染色体长臂为常见的扩增区域，而BCL-6基因正是位于该扩增热点范围内。
　　纵观位于染色体3q27.3的BCL-6基因的研究分析，绝大部分着重于探索BCL-6基因突变和染色体易位在淋巴瘤发生机制中的重要意义；而从一些实体肿瘤的研究结果中可观察到，BCL-6以原癌基因角色介导调控与细胞增殖、分化、侵袭等相关基因的表达。然而，在BCL-6基因与食管癌发生发展的相关性探索里，除提及该基因位于高频扩增的染色体区段，目前尚未发现有从DNA水平或蛋白质水平对这一观察结果进行验证的报道。
　　本实验将首次在新鲜食管癌及癌旁组织中验证BCL-6基因扩增的情况；同时探究BCL-6基因扩增对自身蛋白表达的影响、BCL-6是否在DNA水平或/和蛋白水平参与到食管癌早期癌变过程中。
　　材料与方法：收集汕头大学医学院病理科2014年间术前未经放化疗的潮汕食管癌患者的手术标本共47例。标本均在肿瘤、肿瘤旁粘膜和距肿瘤组织最远处食管粘膜下肌肉等处配对取材，所有取材样本平均分成两组放入Ep管和石蜡包埋盒，并做好记录。样本保存方式：Ep管组织立即放置-80℃冰箱存放；包埋盒组织经中性福尔马林固定后常规脱水，石蜡包埋保存。
　　1.HE染色：石蜡和冰冻组织常规HE染色，观察食管癌（Ca）的病理形态分型、分化程度以及浸润深度等情况，观察食管肿瘤旁粘膜组织学类型：异型增生、单纯增生、正常鳞状上皮分别标记为D、H、N。
　　2.gDNA提取：新鲜标本粘膜下肌肉（M）可直接提取gDNA，其余新鲜组织冰冻切片后HE染色，挑选各例N、H、D、Ca做连续切片，显微切割后提取基因组DNA，检测DNA浓度和纯度。
　　3.Real-time qPCR：检测N/M、H、D、Ca样本gDNA中BCL-6基因扩增的情况。
　　4.IHC染色：采用EnVision二步法检测N、H、D、Ca中BCL-6蛋白的表达强度。
　　5.图像采集：图像采集系统使用Leica DMRXA2全能显微镜和Leica IM50图像采集软件。
　　6.统计分析：应用数据统计分析软件SPSS19.0，采用了非参数检验、卡方检验和Spearman相关分析。P<0.05认为有统计学意义（在N、H、D、Ca组间两两比较时，采用Bonferroni法调整检验水准，P<0.0083有统计学差异），P<0.01有显著统计学意义。
　　结果：
　　1.BCL-6基因相对拷贝数在N/M、H、D、Ca中均值分别为1.0、0.7、2.0、2.3，BCL-6基因的相对拷贝数与食管鳞状上皮癌变过程之间存在正相关关系（P<0.001，Spearman相关系数rs=0.352）；且两两比较发现H与N/M、H与D、H与Ca的BCL-6基因相对拷贝数存在统计学差异（P<0.0083）。在癌组织中，BCL-6基因相对扩增率为60.5％（26/43）。
　　2.BCL-6蛋白表达水平与食管鳞状上皮癌变过程之间存在正相关关系（P<0.001，Spearman相关系数 rs=0.442）；且BCL-6蛋白的阳性表达率在N和Ca之间有统计学差异（P<0.0083）。
　　3.BCL-6基因的相对拷贝数或BCL-6蛋白表达水平与食管癌患者性别、年龄、肿瘤部位、浸润深度、分化程度、淋巴结转移情况和TNM分期无关。（P>0.05）
　　结论：
　　1.在潮汕食管癌变过程中，普遍存在BCL-6基因拷贝数逐渐增高的现象。本研究中，BCL-6基因在癌组织的相对扩增率为60.5%。
　　2.在潮汕食管癌变过程中，BCL-6蛋白表达水平逐级上调。
　　3.BCL-6有望成为辅助食管癌早期诊断及筛选高危人群的生物标记。

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第一章 前言

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 统计分析

第三章 实验结果

3.1 食管组织中BCL-6基因扩增情况

3.2 BCL-6基因扩增与临床病理参数之间的关系

3.3 食管组织中BCL-6蛋白的表达情况

3.4 BCL-6蛋白表达水平与临床病理参数之间的关系

第四章 讨论

4.1 CNV的发现

4.2 CNV的检测方法

4.3 CNV影响基因活性

4.4 基因扩增与食管癌

4.5 BCL-6扩增与食管癌

第五章 研究结论

参考文献

附录

综述

致谢

个人简历