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ABSTRACT
缩略词表
目 录
第一章 前 言
1.细胞稳态和信号通路
细胞需要从细胞外环境中感知线索，并将这些信息整合到适当的发育或生理反应中。虽然有许多机制依赖于将信息从细胞外部传递到胞内，但相对较小一部分高度进化保守的信号通路在传递信息方面依然扮演着特别重要的角色[1]。在这些信号传导机制中，Notch信号通路是目前研究领域中研究成果比较成熟的通路。
众所周知，Notch信号在进化上是保守的，在各个细胞类型以及细胞生长发育过程中的不同阶段发挥作用。为了在不同的组织中实现多个功能，Notch信号在时间和空间上都受到严格控制，因此，Notch信号必须能够在各种细胞环境中产生适当的信号输出。这对Notch信号的通用性在核心通路的分子设计的简单对比下明显体现[1]。在这个信号通路过程中，细胞上的Notch跨膜受体与相邻细胞的跨膜配体相互作用，引发受体的蛋白水解裂解和随后Notch受体胞内段（Notch ICD或NICD）的释放。Notch ICD然后转...
3.NOTCH受体的修饰
Notch受体属于一种异二聚体形式的跨膜蛋白，由胞外区、跨膜结构域构成，后者可被裂解产生的胞内结构域（NICD）。NICD是由若干个域（JM，RAM，ANK，TAD和PEST结构域)构成，包含两个核定位序列和几个锚蛋白序列。这些不同的结构域，可以通过磷酸化、泛素化或乙酰化修饰，蛋白修饰位点如图所示（图1-1）。Notch-ICD的PEST结构域包含多个磷酸化位点，作为随后的泛素化触发点，这是影响Notch-ICD稳定性的关键[1]。目前公认的理论认为Notch-ICD与CSL结合并激活下游基因的转...
图1-1 Notch-ICD的翻译后修饰位点
3.1NOTCH-ICD的泛素化修饰
早先关于泛素化途径在Notch信号调节作用的关注点在于NICD的稳定性调节。Notch胞内结构域包含有典型PEST结构域，它已被证明，Notch的确是迅速通过泛素-蛋白酶体途径多泛素化并降解，即是决定Notch半衰期较短的关键因素[13]。例如，已经有证据表明，一些E3泛素连接酶参与NICD的泛素修饰调节其半衰期[14]。值得注意的是，FBXW7对于NICD的泛素化修饰是在PEST结构域羧基末端磷酸化之后完成的，FBXW7的缺失可以延长NICD的半衰期，并在白血病和其他癌症中产生了显著的效应[15...
最近，关于与Notch受体相互作用并可能影响Notch信号的的输出E3泛素连接酶的报道越来越多（见表1-1）。然而，对这些蛋白相互作用的机制了解相对较少，而且迄今为止，很多也只是在过量表达的条件下观察到这些相互作用。
表 1-1 泛素连接酶参与Notch信号通路的泛素化修饰
4．NOTCH信号通路和乳腺疾病
乳腺癌每年影响全球150万多名妇女，虽然治疗上有了很大改善，但仍然是一个重大的医学问题，而且复发率很高。通过乳腺干细胞向管腔分化，乳腺组织得以正常发育，并且在青春期、妊娠期和哺乳期存在着腺泡肌上皮细胞，和上皮细胞经历形态结构的变化。Notch信号通路参与了乳腺发育的几个步骤，通过抑制Notch信号导致了干/祖细胞池聚集，从而引起导管形态发育紊乱[25]。作为一种分布非常广泛的癌症，Notch信号通路在乳腺癌中可能扮演者肿瘤抑制基因或癌基因的角色，取决于乳腺癌的亚型分型[26]。在乳腺癌细胞中，No...
4.1 Notch3与乳腺癌
4种哺乳动物表达的Notch蛋白，尽管相较于Notch1和Notch2，Notch3只是细微的表现结构的差异，更多表现为限制性的组织分布，主要集中在血管平滑肌，中央神经系统，以及正常调控作用的T细胞[7][39][40]，Notch3的胞外结构域.高度模式化的突变与CADASIL，一种遗传性小血管病变引起中风和老年痴呆症[7]。此外，在几种人类癌症中均有发现Notch3基因的扩增和重组，是Notch3在癌症中充当重要角色的证据[41]。更者，在人类肿瘤细胞系和人类乳腺癌细胞中观测到Notch3表达...
图 1-3 Notch3通过ERα 信号通路抑制乳腺癌上皮间质转化
5.泛素化修饰和乳腺癌
乳腺癌的疾病发生发展阶段中混杂着多种基因、通路分子的的累加变化。一些在乳腺癌领域中被广泛研究的蛋白，包括癌基因、抑癌基因及影响预后的因素，都受泛素化途径调控。泛素化修饰作为调节体内蛋白质翻译后修饰的重要途径之一，同时也是蛋白质降解的重要过程。泛素化修饰中过程与肿瘤的发生、 发展密切相关。此外，许多研究表明，在乳腺癌中E3s是癌基因或抑癌基因。E3泛素连接酶的异常表达与很多的癌症的发病机制相关，并在在不同的信号转导通路的起着控制中心的作用。比如经典的TGF-β信号通路，它的调控机制调节中就包含通路分...
6.高通量筛选技术在细胞水平的研究情况
7.本研究的科学假设
细胞中的蛋白质的更替代谢处于一种合成和降解的动态过程中，保持其正常的蛋白质代谢对于维持正常的细胞功能举足轻重。细胞蛋白的多数（80%）被泛素分子修饰后转由蛋白酶体破坏，相较之下，溶酶体途径只是一个非选择性的途径。Notch信号通路是一条高度进化保守的信号通路。Notch信号通路中关键的一步是水解产生的Notch-ICD与特意的DNA结合蛋白结合，并激活下游基因的转录。早期有文献报道Notch通路在乳腺癌中起着重要作用，而我们实验团队前期的研究证明Notch3在乳腺癌病理过程中充当着抑癌基因的角色。
8.本课题研究目的
9.研究内容
第二章 材料与方法
2.2.1质粒
（1） pGL2-Basic-4xCSL-LUC（Plasmid #41726）报告基因来自美国辛辛那提儿童医院Raphael Kopan教授实验室。
2.3主要试剂
2.4 主要仪器及耗材
2.5 质粒DNA转化
得到用于后续实验的质粒，需利用感受态细胞转化进行扩增。为了保证质粒序列的准确性，提取质粒后采用双酶切实验进行核酸电泳观察结果，另外质粒送检测序。
2.5.1 LB固体培养基配制
2.5.2 LB液体培养基配制
2.5.3质粒转化感受态细胞
2.6 质粒小提
2.7质粒大提
取200 ml（分多次加入50ml离心管，一般可以根据增殖情况决定取液量）恒温箱中菌液，8,000 rpm离心3 min，倒出上清，细菌成团贴壁；
2.8 实时定量 PCR实验
2.8.1 提取细胞RNA实验
2.8.2 RNA逆转录
2.8.3实时定量PCR
2.9蛋白免疫印迹
2.9.1 蛋白的提取
2.9.2 BCA法检测蛋白浓度
2.9.3 蛋白电泳
2.9.4 蛋白质从凝胶中转移到固相载体
剪2张滤纸大小约8cmx4cm和1块9cmx5cm 大小的PVDF膜。裁剪时注意保持剪刀洁净，PVDF膜外包有光面纸，手指尽量不要直接接触膜；
2.9.5 抗体孵育
2.9.6 发光反应
2.10报告基因质粒的构建
2.11 细胞瞬时转染
2.11.1 瞬时转染质粒
2.11.2 瞬时转染siRNA
2.12 高通量RNAi文库筛选
2.13 荧光素酶活性检测
2.13.1 单萤火虫荧光素酶检测
2.13.2 双荧光素酶 萤火虫-海参 检测
2.14 监测蛋白质半衰期实验
2.15 蛋白聚集监测实验
2.16 免疫共沉淀
2.17 统计学分析
第三章 结果与分析
3.1 泛素-蛋白酶体途径参与乳腺癌细胞中Notch3-ICD蛋白的降解
3.1.1 MCF-7细胞的内源性Notch3-ICD蛋白的半衰期的检测，蛋白酶体抑制剂能引起内源性Notch3-ICD聚集
图3-1 MCF-7细胞内源性Notch3-ICD蛋白的半衰期的检测；蛋白酶体抑制剂引起内源性Notch3-ICD的聚集
3.1.2 乳腺癌MDA-MB-231-N3ICD胞外源性Notch3-ICD蛋白的半衰期的检测， MDA-MB-231-N3ICD细胞中外源性Notch3-ICD通过泛素-蛋白酶体途径降解
3.2 反映Notch3含量的荧光素酶报告基因系统的构建
3.2.1 pGL3-Enhancer-4×CSL-LUC报告基因系统的构建
3.2.2 pGL3-Enhancer-4×CSL-LUC报告基因活性在乳腺癌细胞中随Notch3的含量变化而变化
3.3 RNAi文库筛选潜在可能影响Notch3降解的E3连接酶
3.3.1 建立筛选系统
3.3.2 E3连接酶 RNAi文库的筛选结果
3.4 在MCF-7细胞中WWP2作为引起Notch3-ICD泛素蛋白酶体途径降解的E3连接酶
3.4.1 在MCF-7细胞WWP2负向调控Notch3-ICD的蛋白水平表达
3.4.2 MDA-MB-231-N3ICD细胞中外源性的Notch3-ICD 可与WWP2结合
3.4.3 在乳腺癌细胞MCF7细胞中高表达WWP2可缩短Notch3-ICD蛋白半衰期
第四章 讨论
第五章 结论与展望
参考文献
[56]Tomohiko Ohta,Mamoru Fukuda; Ubiquitin and breast cancer.Oncogene(2004) 23,2079–2088.
[65]Neri P.,et al.Bortezomib-induced "BRCAness" sensitizes multiple myeloma cells to PARP inhibitors.Blood.2011 Dec 8;118(24):6368-79.
综 述
[13]B Sanchita,et al. TRIM37 is a new histone H2A ubiquitin ligase and breast cancer oncoprotein.Nature, 2014,516 (7529):116-120.
致 谢
简 历
