体细胞核移植获取治疗性克隆的实验研究

摘要

目前，细胞移植被认为是治疗中枢神经系统因细胞受损或缺失所引发疾病(如：帕金森氏症、阿尔茨海默氏病等)的行之有效方法之一。二十世纪九十年代以来，哺乳动物体细胞核移植技术(Somatic cell nuclear transfer，SCNT)和干细胞技术取得了突破性进展，治疗性克隆(therapeutic cloning，TC)也应运产生，使得利用个体自身正常体细胞核移植获得大量具有供核体自身遗传信息的全能性胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)，并用于细胞移植治疗成为可能，也由此解决了移植治疗所需移植物的来源有限和异体移植免疫排斥等难题，为组织工程研究通过生物技术探寻新的种子细胞源提供了新的途径。 目的： 本研究旨在探讨利用人骨髓基质细胞(human bone marrow stromal cells，hBMSCs)为核供体，建立治疗性克隆胚的可行性及克隆胚体外发育分化能力。 主要方法及结果： 实验首先筛选了有效稳定的激素超排实验方案，以获得满足实验要求的高数量、高质量兔成熟卵母细胞作为核移植受体细胞；分离培养了hBMSCs，并观察其与克隆相关的生物学特性；探讨了适宜的兔卵母细胞孤雌激活方式及体外培养体系，为下一步的治疗性克隆胚激活及培养实验提供相关参照；以hBMSCs为核供体、去核兔MⅡ卵母细胞为核受体建立了治疗性克隆胚，并观察了克隆胚体外发育情况。 1、兔成熟卵母细胞的超排获取 比较孕马血清促性腺激素(pregnant mares serum gonadotropin，PMSG)及促卵泡激素(Follicle-Stimulating Hormone，FSH)两组激素对新西兰大白兔进行超数排卵的效果。PMSG组肌肉注射PMSG 50IU/只，72h后耳缘静脉注射人绒毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin，HCG)150IU/只诱发排卵；FSH组肌肉注射FSH 0.15mg/只/次，早晚各1次，连续3天，第6次FSH注射后12h耳缘静脉注射HCG 150IU/只诱发排卵；HCG注射14～15小时后，以输卵管冲洗(排出)及抽吸卵巢卵泡(抽吸)的方式收集卵母细胞，比较两组的超排效果。 比较FSH恒量注射与FSH递减注射对新西兰大白兔的超排效果。将20只新西兰大白兔随机分为FSH恒量组、FSH递减组。FSH恒量组肌肉注射FSH 0.15mg/只/次，早晚各1次，连续3天；FSH递减组臀部肌肉连续3天6次、每次间隔12h注射FSH，注射的剂量递减，即第1、第2次剂量为0.15mg/只，第3、第4次剂量为0.10mg/只，第5、第6次剂量则为0.05mg/只。两组均在注射第6次FSH 12h后，耳缘静脉注射150IU的HCG诱发排卵，比较两组的超排效果。 结果如下： (1)注射PMSG组从输卵管内冲洗(排出)及抽吸卵巢卵泡(抽吸)分别平均回收了10.42±4.3、12.47±5.6枚卵母细胞；注射FSH组分别平均回收了20.8±10.1、14.64±13.0枚卵母细胞。FSH注射组排出卵母细胞数与PMSG组比较有显著性差别(T=-4.663，P=0.000)，而抽吸组无显著性差别(T=-0.763，P=0.450)。 (2)FSH递减注射组平均排出卵数及抽吸卵数分别为20.94±8.3枚、13.73±14.3枚；恒量注射法的平均排出卵数及抽吸卵数分别为20.8±10.1枚、14.64±13.0枚。经比较递减法与恒量法无论在冲洗排出还是抽吸方式上，所获得的卵母细胞数量均无显著性差别。 2、hBMSCs的培养及其与克隆相关的生物学特性 以Percoll液分离法及反复贴壁法获得hBMSCs。经检测，所获的hBMSCs形态较为一致，呈长梭形，胞核为圆形或椭圆形；原子力显微镜(Atomic ForceMicroscopy,AFM)观察消化后细胞的平均直径约为25～28μm；细胞生长稳定，大部分细胞处于G0/G1期，约占细胞总数的92.58％；具有端粒酶活性；微管微丝免疫荧光染色显示hBMSCs具有正常的细胞骨架结构。对培养第七代的hBMSCs进行染色体分析，被测标本90％以上具有正常染色体数目(2n=46，XY)，且未见染色体异常。 3、兔卵母细胞孤雌激活及激活胚胎的培养 (1)不同激活方式对兔卵母细胞的激活效果差异较大。在存活率上，离子霉素处理与2.0 kv/cm电激活处理比较，两组有显著性差别(p=0.016)，与1.2kv/cm、1.6 kv/cm电激活处理组比较，无显著性差别；离子霉素激活处理的卵母细胞在分裂率、8-16细胞率、桑囊率上，与1.2kv/cm电激活处理组相比，均有显著性差别(P=-0.000，P=0.002,P=0.026)。 (2)添加不同浓度的白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)及胰岛素、转铁蛋白、硒化钠复合物(Insulin+Transferrin+Sodium selenite，ITS)，对孤雌胚胎发育的影响程度不一。 孤雌激活后的兔卵母细胞分别在添加0、10、20、40、80ng/ml LIF的M199培养基中培养。其中，LIF添加与否对孤雌胚胎的分裂率及8-16细胞率没有影响；但添加80ng/ml LIF组的桑囊率与20ng/ml组比较，有显著性差别(p=0.003)。此外，添加20ng/ml LIF组囊胚细胞总数与40ng/ml LIF组、80ng/ml LIF组比较，有显著性差别(P=0.011，P=0.002)，而与添加0 ng/ml LIF、10 ng/ml LIF组之间，无显著性差别。 ITS添加与否对孤雌胚胎的分裂率、8-16细胞率没有影响。添加1×ITS组的桑囊率与2×ITS组相比，有显著性差别(P=0.020)，与0×ITS组比较无显著性差别。此外，0×ITS及1×ITS组的囊胚细胞总数分别为166.00枚、147.40枚，与2×ITS组(78.00枚)比较均有显著性差别(P=0.015，P=0.044)，但两组之间无显著性差别(P=-0.558)。 4、核移植重构胚的建立 以体外培养的hBMSCs为核供体，超排处理后获得的兔成熟去核卵母细胞为核受体，进行核移植、构建重构胚。共收集成熟卵母细胞277枚，经去注核后存活184枚，去注核成功率为66.43％；而后，对其中184枚卵母细胞一供体细胞复合体进行电融合，细胞融合率为53.8％(99/184)，融合后87枚重构胚分裂，分裂率为87.88％(87/99)，其中有55枚进入4细胞期，34枚进入8细胞，12枚进入16细胞期，仅有4枚胚胎发育至囊胚，其桑囊率为4.6％。发育至囊胚后其内细胞团均能孵化，孵化率为100％。 结论： 以兔成熟卵母细胞为核受体，hBMSCs为核供体进行核移植获得了治疗性克隆胚，表明所用去核卵母细胞质支持hBMSCs发育及重编程，形成的核移植重构胚在体外具有进一步发育的潜能。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分家兔超数排卵方法的对比研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分人骨髓基质细胞作为核移植供体细胞的相关生物学特性研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第三部分兔卵母细胞孤雌激活及不同添加物对激活胚胎发育影响的研究

1材料方法

2结果

3讨论

参考文献

第四部分以人骨髓基质细胞为核供体的治疗性克隆的实验研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

全文小结

附图

附录

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致谢