复合抗肿瘤活性珊瑚羟基磷灰石人工骨的研制及实验研究

摘要

一、复合抗肿瘤活性珊瑚羟基磷灰石人工骨的制备及缓释实验 为研究抗肿瘤药物顺铂(cis-diamminedichloroplatinum，CDDP)载入后其在CHA的分布，复合顺铂后CHA作为缓释载体对CDDP的体内外缓释作用。 方法： l、将CHA浸入0.6mg/ml的顺铂磷酸盐溶液中快速振荡30s后负压静置24h，取出CHA利用低温冷冻干燥冻干。分别将0.5g、0.2g、0.1g顺铂用1ml二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)配成溶液后，再加入上述人工骨后再低温冻干。扫描电镜分析复合人工骨断面的孔隙及顺铂的分布情况，用能谱分析了解人工骨内部所复合顺铂的含量。 2、以复合20％顺铂的CCHA为实验对象，将CCHA样本避光浸入10mmo/L的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer，PB)中37℃、30转/分浸泡振荡，每2天更换10ml磷酸盐缓冲液。 3、利用3％戊巴比妥钠(30mg/kg)将SD大鼠麻醉后，经手术将100mg CCHA颗粒经手术植入SD大鼠背部肌袋中，术后定期取材时行大体观察、X线摄片检查，观察动物重要脏器的一般情况，材料及周围组织有无感染等不良反应，取动物静脉血和复合人工骨植入处周围l cm及1cm-2cm范围的肌肉组织匀浆后检测顺铂含量。 4、利用高效液相色谱法检测体外缓释试验浸提液、体内缓释试验肌肉组织及血液中顺铂的浓度。 结果显示： l、顺铂在CHA孔隙内分布均匀，CHA的孔隙结构未改变； 2、利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)检测体外浸提液、动物静脉血及组织匀浆液中的顺铂浓度结果示顺铂和内标液的保留时间分别为4.6 min和7.5 min，两者分离效果良好。 3、体外缓释液中前2周顺铂出现快速释放，体外浸提液中顺铂的浓度极高(2周时浓度为753.01±64.89)；至12周其顺铂浓度仍达到134.54±9.88μg/ml。 4、动物植入CCHA后局部较长时间内可维持较高顺铂浓度，随着时间的延长及与人工骨的距离增加局部的顺铂浓度呈下降趋势，距离人工骨1cm-2cm内的的顺铂浓度低于人工骨周围1cmm组织内顺铂浓度，除7d时两组间比较无显著性差异外(P=0.06)，其余时间两者间比较存在显著性差异。 5、CCHA植入后动物血液中顺铂的浓度稳定在较低水平，平均不超过17μg/ml，远低于体内缓释试验中局部组织中的顺铂浓度。 6、动物各重要脏器大体及组织切片示CCHA植入后对动物机体无不良影响。小结：CCHA具有良好的缓释效能，可在局部维持一定时间高药物浓度。 小结：CCHA具有良好的缓释效能，可在局部维持一定时间高药物浓度。 二、复合人工骨体外抗肿瘤实验研究 CCHA作为抗肿瘤人工骨的体外抑制肿瘤细胞作用，为进一步行体内抗肿瘤实验研究及临床应用提供理论依据。为了使CCHA更加适合临床相关骨肿瘤的应用，我们首先从临床取得明确诊断为骨巨细胞瘤及乳腺腺癌骨转移标本进行原代细胞培养，成功获取骨巨细胞瘤及骨转移乳腺腺癌原代培养瘤细胞，通过对原代培养瘤细胞进行光镜、电镜下形态学观察并与国内外文献报道结果相比较，原代培养细胞离心后行常规病理切片HE染色、免疫组织/细胞化学检测及接种于裸鼠建立肿瘤模型后取得的瘤结节组织切片HE染色与临床组织标本的病理切片进行对比，对瘤细胞进行鉴定，确定实验所培养的细胞为所需的瘤细胞。再明确成功获取上述两种肿瘤原代培养瘤细胞基础上选用四肢常见骨恶性肿瘤一骨肉瘤细胞株U-2OS，脊柱转移瘤中其他最常见的肿瘤．人高转移性肺腺癌细胞株SPCA-1、前列腺癌骨转移细胞株PC-3、人高转移性结肠腺癌细胞株LOVO细胞株为实验对象。将第一部分实验所得的CCHA及CHA体外缓释液冻干粉再用与其冻干前相同体积的培养基溶解后作用于培养的瘤细胞，其中CHA的体外缓释液为对照组，光镜下观察浸提液对瘤细胞的作用情况，并利用四唑盐(MTT)比色法检测其对上述细胞的抑制率。结果发现，对照CHA组浸提液对瘤细胞生长没有明显的抑制作用，再次说明自制的CHA具有良好的生物相容性；实验CCHA组8周内不同时间的浸提液对上述6种瘤细胞均有不同程度的抑制作用，加入浸提液后各系瘤细胞生长均受到不同程度的抑制，细胞皱缩，部分细胞崩解死亡；MTT结果显示乳腺腺癌原代培养细胞、肺腺癌SPCA-1、骨肉瘤细胞株U-2OS及结肠腺癌LOVO细胞株对CCHA浸提液较敏感，8周内浸提液的抑制率均超过50％。 小结：CCHA在体外对多系骨相关肿瘤细胞具有良好的抑制作用。 三、复合人工骨体内抗肿瘤实验 进一步研究在体内状态下CCHA人工骨的抗肿瘤活性。利用骨巨细胞瘤原代培养细胞、骨肉瘤细胞株U-2OS、肺癌细胞株SPCA-1、前列腺癌细胞株PC-3、结肠腺癌LOVO细胞株及乳腺癌原代培养瘤细胞接种于裸鼠建立肿瘤模型，结果示骨巨细胞瘤成瘤率较低且瘤结节生长较慢，本实验中共20个接种点仅成瘤4个瘤结节。乳腺癌肿瘤模型未建立成功，其余肿瘤成瘤率较高，其中肺癌及结肠腺癌瘤结节生长较快。在瘤结节成瘤后10天，经手术将实验组CCHA及对照组CHA人工骨颗粒嵌入裸鼠肿瘤模型的瘤结节内，予相同条件下培养，观察动物在人工骨植入前后的一般活动、局部伤口、瘤结节大小等情况，术后10天处死取材，再观察裸鼠心脏、肝脏、肾脏及肺等重要脏器的颜色、大小及行组织切片常规H-E染色了解人工骨植入是否对裸鼠机体存在损伤作用，是否存在远处转移等情况。比较对照组及实验组人工骨植入前后瘤结节体积大小的变化，切取、制作并比较两组已植入人工骨瘤结节的脱钙H-E染色组织切片以了解CcHA体内对肿瘤的抑制情况。结果示：骨巨细胞瘤模型中两处瘤结节植入CCHA后，瘤结节出现明显缩小并逐渐出现包括局部小块皮肤在内的干性坏死，对照组植入CHA后瘤结节无明显变化。肺癌肿瘤模型在裸鼠接种瘤细胞后4-7天于颈背部或前臂腋窝处及后背部出现肿块，并迅速膨大。成瘤后10天行人工骨植入前肿瘤结节平均体积为735.67±116.11mm<'3>。人工骨植入后可见对照CHA组裸鼠肿瘤呈现恶性持续增长。实验组CCt{A植入后肿瘤出现明显生长抑制，肿瘤体积减小，部分瘤结节及局部皮肢出现干性坏死，瘤结节取材时平均体积为132.13±51.10mm<'3>，与对照CHA植入组(取材时平均体积为4564.33±320.03mm<'3>)相比有显著性差异(P=0.001)。 小结：CCHA在体内对多系骨相关肿瘤细胞具有良好的抑制作用。 四、复合人工骨体内成骨实验 由于所有化疗药物对机体的作用存有两面性，CCHA所复合的药物量较大，植入体内后局部药物浓度较高，对可能残留的肿瘤细胞有杀伤作用的同时对正常的周围组织也存在一定的杀伤作用，其植入骨缺损后可能影响骨诱导、骨传导及骨生长的作用，从而无法与周围骨缺损形成骨愈合。为了进一步研究自制CHA在体内的降解和新骨替代行为以及CCHA植入体内后能否起到骨支架、骨传导及骨生长的作用，与骨缺损之间形成骨愈合，为将来CCHA的进一步改进及用于修复骨缺损的研究及临床应用提供理论依据。实验组及对照组，经手术分别将CCHA及CHA人工骨植入兔股骨两干骺端的骨缺损模型中，术后定期行大体观察、两股骨X线片及取材行组织切片，观察材料降解和被新骨替代的速度、骨与材料界面的结合情况，材料内部新骨生长情况。结果示：术后动物一般情况良好，伤口愈合良好，无不良并发症；CHA植入后比CCHA较快与周围骨形成组织及骨桥连接，植入4周后X线片影像示CHA边缘开始逐渐不清，组织切片显示周围早期有疏松结缔组织长入材料孔隙内，紧贴材料孔壁富含成骨细胞且逐渐有类骨质及骨细胞形成，材料周边及中央区多处出现新骨质生长并逐渐连接融合替代材料形成骨小梁，且与动物骨形成骨愈合。CCHA植入后早期约8周内局部以抑制组织细胞生长为主，6周至12周逐渐有组织结构向材料孔隙内生长且逐渐出现成骨细胞、骨基质及骨细胞，新生骨逐渐生长替代融合，于26周左右与周围骨形成骨愈合，28周左右材料周边及中央区的成骨情况基本跟对照组CHA植入一致，说明CCHA植入早期虽对骨愈合有一定的抑制作用，但最终仍可自行与周围骨缺损达到骨愈合。 小结：CCHA在体内与CHA一样具有成骨作用，能使骨缺损愈合。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分复合抗肿瘤活性珊瑚羟基磷灰石人工骨的制各及缓释实验

实验一　抗肿瘤珊瑚羟基磷灰石人工骨的制备

实验二　复合人工骨体外缓释试验

实验三　复合人工骨体内缓释试验

实验四　高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定顺铂浓度

结果

讨论

第二部分复合人工骨体外抗肿瘤实验

材料与方法

结果

讨论

第三部分复合人工骨体内抗肿瘤实验

材料与方法

结果

讨论

第四部分复合人工骨体内成骨实验

材料与方法

结果

讨论

全文小结

参考文献

附录

成果

致谢