内皮抑素抗血管生成基因治疗子宫内膜异位症的实验研究

摘要

子宫内膜异位症(Endometriosis，EM，内异症)是女性常见疾病，主要引起不孕、痛经、性交痛及慢性盆腔痛等症状。 蛋白治疗和基因治疗是目前最常用的治疗方法。蛋白治疗具有一些难以克服的缺陷，如治疗剂量大、血药浓度维持时间短、需反复注射、所需疗程长以及可能传播毒性和感染颗粒等，造成蛋白治疗严重受限。 本课题拟通过分子生物学、实验动物学、病理学和免疫学的相关技术，利用改进的携带绿色荧光蛋白的AdEasy-1腺病毒载体系统，构建携带人内皮抑素基因的重组腺病毒，包装、扩增、纯化后，体外感染人脐静脉内皮细胞，诱导其发生凋亡；建立人内异症裸鼠皮下种植及腹腔注射模型，研究其血管生成特性，并用重组腺病毒局部注射裸鼠异位子宫内膜病灶，观察内皮抑素抑制异位内膜病灶生长情况以及可能出现的毒副反应，研究内皮抑素基因治疗内异症的可行性和安全性，为内异症的治疗寻找一种新方法，探索一条副作用小、便捷、经济的治疗新途径，解除患者痛苦，降低复发率，减少癌变，提高生育能力，改善临床治疗效果，提高患病妇女的生活质量。 方法： 1.利用改进的携带绿色荧光蛋白的AdEasy-1腺病毒载体系统，构建携带人内皮抑素基因的重组腺病毒质粒，并转染病毒的包装细胞以包装、大量扩增重组腺病毒，用上述相同的方法制备对照空载腺病毒。 2.重组腺病毒体外感染人脐静脉内皮细胞ECV304，利用逆转录聚合酶链反应及免疫印迹等不同方法检测人内皮抑素基因的转录及其蛋白的表达情况。 3.利用多种方法检测重组腺病毒感染的不同时期，人脐静脉内皮细胞ECV304凋亡的情况。 4.应用子宫内膜异位症患者的在位内膜，建立人子宫内膜异位症裸鼠皮下种植及腹腔注射模型，建模后观察裸鼠皮色、食欲、活动情况及皮下种植结节的生长情况；2周后处死裸鼠，HE染色光镜观察及免疫组织化学法检测异位内膜病灶的形成情况及微血管生成情况；并测量分析裸鼠体重变化情况，评价造模的毒副作用。 5.采用人内异症裸鼠皮下种植模型，将重组腺病毒液、对照空载腺病毒液及生理盐水分别进行皮下异位内膜病灶局部注射，观察注射后异位内膜病灶的生长情况，并观察裸鼠活动、皮色、食欲等情况；注射后2周处死裸鼠，比较各组裸鼠异位病灶体积的变化，HE染色光镜观察异位病灶的形态，并应用免疫组织化学法进行微血管密度计数和血管内皮生长因子表达的检测；测量分析裸鼠体重变化情况，评价治疗的毒副作用。 结果： 1.以特异性真核表达质粒Pshuttle-Endostatin为模板，利用特异性上下游引物，应用聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)技术成功扩增得到编码人内皮抑素Endostatin蛋白的基因片段，大小约650pb，与预期的结果相符；将该基因片断大量扩增并纯化，经Xbal及KpnI两种特异性酶切后定向克隆到携带绿色荧光蛋白(greenfluorecenceprotein，GFP)的AdEasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV中，构建了重组穿梭质粒pAdTrack-Endo，经特异性酶切反应鉴定及DNA测定鉴定，证实重组穿梭质粒pAdTrack-Endo构建成功；将重组穿梭质粒pAdTrack-Endo大量扩增纯化后，经特异性核酸内切酶PmeI线形化，再与腺病毒基因组骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，利用细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdEasy-Endo，经特异性酶切鉴定及DNA测序鉴定，证明携带人内皮抑素基因的重组腺病毒质粒pAdEasy-Endo构建正确；重组腺病毒质粒pAdEasy-Endo大量扩增纯化后，经特异性核酸内切酶PacI线形化，在体外利用脂质体2000成功转染病毒包装细胞AAV293，最早在转染后16小时，在荧光显微镜下可见GFP的表达，后荧光逐渐增多增亮，约至转染后5～9天，细胞开始膨胀变圆，触角逐渐消失，荧光也不再增加，并有部分细胞开始悬浮，细胞呈串珠样改变，表明病毒的形成和扩增；约在转染后14天，大部分AAV293细胞胞体固缩、悬浮，收集细胞裂解液进行PCR鉴定，得到预期650bp大小的Endostatin基因条带，证实重组腺病毒pAd.Endo已包装成功。利用终点稀释法(End-PointDilutionAssay)测得，扩增纯化后获得的重组腺病毒pAd-Endo及空载腺病毒pAd-Track的滴度(Titer)分别为2.06×1010pfu/ml和1.73×1010pfu/ml。 2.采用不同MOI的病毒液感染ECV304细胞，感染后培养48h在荧光显微镜下观察ECV304细胞的感染效率，结果可见：当MOI为1时，仅有10％左右的细胞有荧光表达；当MOI为100时，约有95％以上的细胞GFP表达阳性。用逆转录聚合酶链反应(ReverseTranscriptPolymeraseChainReaction，RT-PCR)检测到被感染的ECV304细胞中EndostatinmRNA的表达，而阴性对照中无表达；免疫印迹法(Westernblot)检测到被感染的ECV304细胞中有分子量约为20KD的蛋白质表达，而阴性对照中无表达，表明重组腺病毒感染ECV304细胞后，Endostatin基因进行了有效的转录及蛋白的表达。 3.应用流式细胞仪、Hoechest33258染色、DNALadder等检测方法，均发现感染重组腺病毒后，ECV304细胞发生了显著的凋亡，并随着感染时间的延长，凋亡率呈上升趋势。 4.将6～10周龄的BALB/c雌性裸鼠20只，随机分为两组，利用卵巢巧克力囊肿或子宫腺肌症患者的在位内膜，经皮下种植及腹腔注射两种方法成功建立人子宫内膜异位症裸鼠模型，两组均无死亡例数。两组均于造模后14日处死，探查腹腔注射组有8只成模，每只约1～2个病灶不等，成功率为80.0％，大体观察可见病灶多位于盆腹腔的腹壁、肠系膜，肠管和肝表面，大小约2.0mm×2.0mm×2.0mm左右，呈清亮水疱样结构，表面有小血管爬行，部分可见粘连带与腹壁相连；皮下种植组有9只成模，成功率为90％，腹部切口均于术后3天愈合，每3天观察一次种植病灶结节，约于第12天形成大小约2.0mm×2.0mm×2.0mm结节样突起结构。两种方法造模成功率比较，其差异无显著性意义(P=1.000)。腹腔注射及皮下接种两种造模方法的异位病灶标本HE染色光镜下均可见类似子宫内膜样的腺体和间质结构，腺上皮细胞呈柱状或扁平状，病灶边缘与裸鼠肌细胞层相延续，部分切片中可见间质细胞侵入肌层的现象；血管内皮细胞生长因子(VascularEndothelialcellGrowthFactor，VEGF)蛋白阳性表达表现为胞浆棕色颗粒，在两组共17个异位病灶组织的腺上皮、间质及血管内皮中均有表达；微血管计数应用免疫组化法，CD34阳性染色定位于血管内皮细胞，呈棕黄色，微血管有的形成管腔，有的仅为单个内皮细胞或内皮细胞簇；两组共17个异位病灶组织均有较多的微血管生成，两种造模方法均未观察到明显的毒副作用。 5.将造模后4周的30只皮下种植裸鼠模型随机分为三组：治疗组(pAd-Endo)、阴性对照组(pAd-Track)及空白对照组(生理盐水)。病灶局部注射后2周处死全部裸鼠，分别测量异位病灶的体积，经重复测量方差分析，结果显示各组间差异有显著性意义(F=612.717，P=0.000)，治疗组病灶体积低于阴性对照及空白对照组；治疗组病灶体积减小，其差异有显著性意义(F=817.754，P=0.000)，阴性及空白对照组体积变化均无显著性意义(P均>0.05)，治疗方法同体积之间有交互作用(F=753.460，P=0.000)，提示不同组别治疗前后，体积变化趋势不同。标本HE染色，光镜下可见治疗组腺体萎缩明显，部分结构不完整，间质伴有不同程度的坏死。 结论： 1.改进的AdEasy-1腺病毒载体是一种高效、安全、便捷的基因载体系统，其拥有多个特异性酶切位点可供选择，实验操作简单方便；其携带的绿色荧光蛋白便于观察追踪；腺病毒感染目的细胞的效率很高，并且能进行有效的增殖，产生较高的病毒滴度。 2.重组腺病毒感染人脐静脉内皮细胞后，人内皮抑素基因有效的进行了的转录和蛋白表达，证实了病毒功能的完整性，也完成了内皮抑素从基因到蛋白水平的功能转化。 3.内皮抑素在体外可以成功诱导人脐静脉内皮细胞ECV304发生凋亡，随着感染时间的延长，细胞凋亡率呈上升趋势，这可能是内皮抑素能够拮抗新生血管生成的机理之一。 4.子宫内膜异位症患者的在位内膜具有较强的异位种植及促新生血管生成的能力，可以作为建立人子宫内膜异位症动物模型的原料，增殖期及分泌期子宫内膜均可成功建立裸鼠模型；腹腔注射及皮下种植均是成功率较高的造模方式，且未观察到明显的毒副作用，具有较高的安全性。 5.人内异症裸鼠皮下种植模型更加直观方便，有利于病灶体积变化及治疗效果的观察；采用病灶局部注射的治疗方法，操作简单，治疗靶向性强、治疗作用集中，全身的毒副反应轻微；综合病灶体积分析、VEGF表达及微血管密度计数三个因素可以较全面的评价新生血管的生成及抑制情况。 以上研究表明：人内皮抑素抗血管生成基因治疗可能成为子宫内膜异位症安全有效的治疗途径。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词表

声明

前言

第一部分携带人内皮抑素基因重组腺病毒的构建

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

第二部分人内皮抑素基因的体外表达

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

第三部分人内皮抑素基因体外诱导人脐静脉内皮细胞凋亡

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

讨论

小结

第四部分人子宫内膜异位症裸鼠模型的建立、血管生成的观察

前言

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

讨论

小结

第五部分内皮抑素抑制裸鼠异位子宫内膜灶生长的研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

讨论

小结

全文小结

参考文献

子宫内膜异位症血管生成及其抑制治疗的研究进展

攻读学位期间成果

致谢

统计学证明