四种不同种属鼠的皮肤黑色素分布及α-MSH表达研究

摘要

一、目的与意义： 色素代谢障碍性疾病(如黄褐斑、白癜风)，发病率高，严重影响患者生活质量，临床缺乏理想疗效的关键是有关色素调节的影响因素、作用机理与规律未能得到深入的科学阐述；而动物实验则是医学发展的基础与条件，实验动物更是医学研究的重要载体和手段。当前国内外不少学者已展开对色素代谢障碍性疾病动物实验的研究，但大多数报道的是某一疾病动物模型的建造方法或药物对酪氨酸酶活性与黑素细胞增殖或抑制作用的影响，而不同观察指标与适宜实验动物的选择问题及更深入的研究还是欠缺。 事实上，由于实验动物的种属、品系等的不同，其解剖、生理、病理、遗传倾向及实验敏感性等生物学特性亦有所差异，会对动物实验的成功与否具有不同程度的影响。究竟哪种动物是色素代谢实验模型的理想选择，依据是什么? 目前研究认为，色素代谢障碍性疾病主要是皮肤黑素代谢障碍所引起的，而黑素主要由黑素细胞分泌。黑素细胞含有黑素生成酶(酪氨酸酶)，在酪氨酸酶的作用下，酪氨酸逐渐被氧化，接着重新排列并聚合，最后与蛋白质结合为黑素蛋白。因此，国内外文献研究多针对酪氨酸酶活性对黑素细胞增殖或抑制作用的影响。最近研究证实，表皮细胞中黑素细胞能产生和分解阿黑皮素原，生成a-黑素细胞刺激素(a-melanocyte-stimulatinghormone，a-MSH)，再与黑皮素-1(MC1R)受体结合，激活腺甘酸环化酶，提高细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平，进而激活cAMP倚赖蛋白激酶，促进酪氨酸酶的合成及表达，促进黑素细胞有丝分裂，使黑素细胞快速增值，促进黑素合成。因此，a-MSH也对黑素生成具有重要意义。 为了能够进一步说明色素代谢障碍性疾病实验研究的动物选择问题，并能够深入探讨黑素细胞刺激素可能的影响机制，我们对SPF级雌性昆明种小白鼠、C57BL/6J小黑鼠、雌性白色FMN豚鼠及棕黄色HARTLY豚鼠四种常用于色素病实验研究的动物进行了有关皮肤表皮黑色素分布及a-MSH表达情况的对比观察研究，以期为选择合理的实验动物及深入探讨黑素细胞刺激素的影响机制提供必要的理论和实验依据。 二、方法与内容： 购进正常的SPF级雌性昆明种小白鼠、C57BL/6J小黑鼠、雌性白色FMN豚鼠及棕黄色HARTLY豚鼠各12只，各组小鼠预养3天，正常喂养1周后，于第8天上午将各组动物用3％戊巴比妥45mg/Kg腹腔麻醉后，作常规固定，刮除背部皮肤表面毛发，用组织剪剪取2cm×2cm大小皮肤数块，10％中性甲醛固定，常规石蜡切片备用； 1、四种不同种属鼠的皮肤表皮黑色素分布情况的观察研究 随机在每组选择相同数量的标本，脱蜡至水，抗原修复后，用MouseAnti-HumanMelanomaMonoclonalAntibody为第一抗体，以免疫组织化学方法(具体操作按相关试剂盒说明)显示表皮中的黑色素颗粒，用缓冲液替代第一抗体做阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照，在200倍显微镜下观察黑色素阳性细胞在表皮中的分布情况，并进一步用Imagetools3.0图像分析软件分析细胞平均截面积和灰度值。 2、四种不同种属鼠的皮肤表皮a-MSH表达情况的观察研究 随机在每组选择相同数量的标本，脱蜡至水，抗原修复后，用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(S-P)常规染色法检测a-MSH在表皮的阳性表达情况，用缓冲液替代第一抗体做阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。然后将标本均用200倍显微镜下随机选择20个视野观察表皮a-MSH阳性细胞分布情况，并由JVC彩色摄像头将细胞图像输入Mias系统拍照。 最后采用相应的计分方法，分别对动物皮肤表皮表皮黑色素及a-MSH阳性细胞进行统计计分，并应用SPSS13.0统计软件，对实验结果加以分析，均以a=0.05，P<0.05时判为有显著性差异； 三、结果： 1、四种不同种属鼠的皮肤表皮黑色素分布情况的观察结果 在SPF级雌性昆明种小白鼠和雌性白色FMN豚鼠的表皮及毛囊中几乎未见阳性表达的黑色素颗粒，C57BL/6J小黑鼠可见黑色素颗粒成簇分布于毛囊基底细胞团中，在表皮中几乎未见阳性表达的黑色素颗粒，棕黄色HARTLY豚鼠基底层细胞间及毛囊中均可见黑色素颗粒阳性反应的黑素细胞，中间层的角质形成细胞内有时可见少量被吞噬的淡染的黑色素颗粒存在；棕黄色HARTLY豚鼠阳性细胞数、截面积、灰度值均优于其他三组动物(P<0.01)；C57BL/6J小黑鼠阳性细胞数、截面积、灰度值均优两组白色动物(P<0.01)；两组白色动物阳性细胞数、截面积、灰度值均无明显差异(P>0.05)。 2、四种不同种属鼠的皮肤表皮a-MSH表达情况的观察结果 在SPF级雌性昆明种小白鼠和雌性白色FMN豚鼠的表皮及毛囊中几乎未见阳性表达的a-MSH细胞，阳性表达率均为0.00％，C57BL/6J小黑鼠可见a-MSH分布于毛囊基底细胞团中，在表皮中几乎未见阳性表达的a-MSH细胞，阳性表达率为20.00％，棕黄色HARTLY豚鼠基底层细胞间及毛囊中均可见阳性表达的a-MSH，在表皮黑素细胞的胞浆或细胞外基质，为黄或棕黄色颗粒，呈局灶性或弥漫性分布阳性表达率为55.00％。且a-MSH在C57BL/6J小黑鼠毛囊黑素细胞及棕黄色HARTLY豚鼠表皮黑素细胞的阳性表达有显著性差异(P<0.01)。 四、结论： 1、白色昆明雌性小鼠及白色FMN雌性豚鼠不适宜用作观测皮肤表皮及毛囊黑色素或a-MSH变化情况的实验研究，可考虑用于色素增加性实验模型及药物的研究； 2、C57BL/6J小黑鼠适宜用作色素代谢障碍性皮肤疾病的实验动物，但仅适宜用于观测毛囊a-MSH变化情况的实验研究： 3、棕黄色HARTLY豚鼠则适宜用做观察皮肤表皮及毛囊的黑色素或a-MSH变化情况的实验研究； 4、棕黄色HARTLY豚鼠的表皮及毛囊黑色素细胞分泌黑色素的能力优于C57BL/6J小黑鼠的表皮及毛囊黑色素细胞，有统计学意义，因此棕黄色HARTLY豚鼠比C57BL/6J小黑鼠更适宜用于色素代谢障碍性皮肤疾病动物实验研究； 5、本实验提示我们，目前已初步具备了对a-MSH进行研究的实验条件，由于a-MSH在黑色素代谢过程中的调控作用较酪氨酸酶更为细致深入，因此在色素代谢障碍性皮肤疾病研究中，可将a-MSH作为一个较酪氨酸酶更为深入的指标，用来探索色素病的发病机理及相关的药理作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章前言

第2章四种不同种属鼠的皮肤黑色素分布情况的观察研究

第1节材料

第2节方法

第3节结果

第4节讨论

第3章四种不同种属鼠的皮肤表皮α-MSH表达情况的观察研究

第1节材料

第2节方法

第3节结果

第4节讨论

全文小结

参考文献

附录1英文缩略词表

附录2文献综述 色素代谢障碍性疾病动物模型的研究现状及展望

成果

致谢

研究生毕业论文统计学审稿证明