小鼠肺组织钩虫感染时间序列基因表达谱的生物信息学分析

摘要

生物信息学作为一种生物数据存储、检索和分析的工具，已经成为生命科学研究中必可不少的研究手段，其中对基因芯片的数据分析是至关重要的环节。基因芯片在一次实验中能够检测多个基因甚至整个基因组表达的情况，获得的数据量可能十分庞大，因此，为了将这些宝贵的资源从海量的芯片数据中挖掘出来，并转化为有用的生物学知识，需要借助有效的数据挖掘工具。GeneSifler软件是一个集统计分析和生物功能分析为一体的生物信息学在线系统，提供便捷高效的综合分析工具，并支持多种微阵列平台。其中OneClickGeneSummary可以快速提供单个基因的功能注解，R语言和Bioconductor微阵列数据包提供了强大的统计学分析方法，GeneOntology可以通过Z介值自动限定一组基因的生物学意义，KEGG显示差异基因的信号转导通路，这些工具都为基因芯片的数据挖掘提供了很好的平台。 基因表达是在一定调节机制控制下进行的，生物体随时调整不同基因的表达状态，以适应环境、维持生长和发育的需要。也就是说，基因表达表现为一个动态的过程，只有在连续的时间点对基因表达值进行检测分析，才能真正把握基因表达在体内的变化情况，了解疾病发生演变的机理。本研究对小鼠肺钩虫感染的36张芯片数据(GEO系列号为GSE3414)进行分析，分别检测钩虫感染后第0、2、3、4、8、12天，野生型(WT)小鼠和重度联合免疫缺陷型(SCID)小鼠体内的基因表达值，观测基因在体内的变化过程，发现特征基因以及探索基因间的相互作用机制。 本研究分为四个部分： 第一部分研究使用GeneSifter在线软件对GSE3414数据进行分析，设定Ratio值为1.5，数据经过对数转换，得到6764个差异基因，对这些差异基因建立子项目Infectiontimeseries：Filter.使用two-wayANOVA统计学方法，限定因素strainandtime，取为2；levels为6；筛选出了三组数据，p值小于0.001具有时间效应的基因1054个，种系效应基因517个，以及交互作用的基因54个。在寄生虫感染时，WT小鼠具有完整的免疫系统，能够发动适应性免疫反应；而SCID小鼠由于缺乏功能性B和T细胞，只能产生天然免疫反应。因此具有种系效应的差异基因也就是与功能性T细胞相关的基因；而时间效应基因是也就是参与天然免疫反应的基因。交互效应基因则是时间和种系两种因素同时作用的差异基因，显示了钩虫感染对机体的影响。 第二部分研究对上述具有种系效应的差异基因，建立子项目Infectiontimeseries：Filter：strain，选择proiect对这517个基因进行数据分析。通过对基因和样品的分层聚类，来限定数据组模式，最终得到聚类数为2，分为高表达和低表达两组。分别对这两组基因进行GO分子功能分析、KEGG信号转导通路分析和InterPro表达产物结构分析。结果显示肌萎缩侧索硬化(ALS)信号转导通路在两组小鼠间的差异具有统计学意义，Z=2.45。分子功能的Z值报告显示WTT小鼠体内基质金属蛋白酶的活性明显降低，其编码基因Adamts8在WT小鼠比SCID小鼠中的表达值显著减少。Adamts8的二级结构中包含金属肽酶结构以及锌离子结合位点，显示具有基质金属蛋白酶活性和结合金属锌离子的能力。 由于具有种系效应的差异基因也就是与Th2细胞相关的基因，ALS信号转导通路在两组小鼠间的差异具有统计学意义，在野生型小鼠组显示ALS通路被抑制，推测ALS属于自身免疫性疾病，Th2型细胞免疫对ALS起到抑制作用。根据文献挖掘结果，ALS病人体内存在IV-型胶原代谢异常，氧化应激反应的紊乱，和锌离子的分布异常，后两个因素可能对ALS的病理学过程中起着重要作用。本研究发现的差异基因Mmp2和Adamts8表达产物为基质金属蛋白酶家族成员，可降解多种ECM成分，它们的在WT小鼠中表达下调会导致体内IV型胶原，纤维连接蛋白增多，这与ALS患者体内胶原代谢异常恰好相反。另外，两者的基因产物都可以与锌离子结合，具有金属肽酶活性。Mmp2和Adamts8的低表达引起与锌离子结合的基因产物减少，会导致体内锌离子浓度升高。因此，这两个基因可能同时通过影响胶原代谢和锌离子水平，对ALS起到保护性作用。基因Idh1表达产物为可溶性异柠檬酸脱氢酶，与镁离子、锰离子结合，具有抗氧化酶活性。它在WT小鼠体内呈高表达状态，具有逆转氧化应激紊乱的趋势。因此，从这两个基因入手，有望发展新的针对ALS的治疗策略。 第三部分研究对具有时间效应的基因，建立子项目Infectiontimeseries：Filter：time，选择project对这1054个基因进行数据分析。通过对基因和样品的分层聚类，来限定数据组模式，使用PAM方法来确定最佳聚类数，得到聚类数为2;对两组数据进行生物学过程分析；使用Sting和TFM分析软件，构建粘附分子及相关转录因子作用关系网络。结果发现促进细胞外基质修复和创伤愈合的基因有Pcna、uacilDNAglycosylase、Fnl和Cd44；氧化剂杀伤作用基因为Prdxl。差异基因表达产物及转录因子相互作用图显示差异基因Itgb1处于整个通路的核心位置，差异基因Cd44同时作用于六个基因，处于另一个中心点。因此这两个基因共同控制着整个粘附分子通路。REL作为转录因子，直接调控Cd44，Itgb1，Itgb6，Itgb7基因，这些基因之间具有协同作用。 通过各种途径和药物抑制调节黏附分子及其介导的细胞黏附作用，已证明可成为炎症损伤及多种疾病的有效调节和防治手段。因此，通过转录因子REL，可能从根本上控制急性肺损伤的发生发展。另外，通过抑制具有氧化剂杀伤作用的差异基因Prdx1，可能有助于减轻急性肺损伤症状，而Pcna、uacilDNAglycosylase、Fn1、Cd44基因的激活则促进肺组织的修复。因此，这些差异基因和转录因子REL有望从多个水平对急性肺损伤起到综合的防治作用。 第四部分研究对上述具有种系效应的基因，建立子项目Infectiontimeseries：Filter：interaction，选择proiect对这54个基因进行数据分析。通过对基因和样品的分层聚类，来限定数据组模式，得到聚类数为3；分别对三组数据进行差异基因分子功能分析、One-ClickGeneSummary分析，以及String蛋白质相互关系网络构建和TFM转录因子预测，使用HNN和ELM法对未知功能基因编码产物结构进行预测。结果显示WT组小鼠主要抑制的基因及生物学过程，包括细胞凋亡和程序性细胞死亡的正向调控、天然免疫反应、自然杀伤细胞介导的细胞毒性调控、整合蛋白介导的信号通路、淋巴细胞介导的免疫反应及细胞毒性的加强、氧化亚氮的生物合成及代谢、干扰素γ产物的调控、核苷核酸代谢过程及其调控，其中Z值最高的是生物节律和细胞杀伤过程。对未知功能基因ALS2CR13进行功能位点分析发现，有两个功能位点LIG_TRAF2_1和LIG_TRAF6分别与TRAF-2和TRAF6结合，参与细胞免疫反应。本研究揭示钩虫主要通过抑制适应性免疫反应而抑制宿主的免疫系统，并发现特异基因Klrk1和Ulbp1为钩虫抑制的主要基因，转录因子FORKHEAD起到关键性调控作用。ALS2CR13基因作为肌萎缩侧索硬化2号染色体候选基因，与自身免疫性疾病和Th2细胞免疫密切相关，这进一步验证了种系效应研究中所发现的ALS的可能发病机制。 综上所述，本研究首先使用倍数值限定和two-wayANOVA统计学方法，对小鼠肺组织钩虫感染芯片数据GSE3414过滤后得到三组数据，P值小于0.001具有时间效应的基因1054个，种系效应基因517个，以及交互作用的基因54个。然后采用GeneOntology(GO)分析、KEGG信号转导通路分析、OneClickGeneSummary基因功能注解、String蛋白质相互作用网络和TFM相关转录因子分析软件以及基因表达产物结构功能预测，分别对这三组数据进行深入的生物学分析，本研究发现了治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的重要基因靶点，并从基因水平对ALS的发病机制进行探讨；构建粘附分子作用网络，发展出从多个水平治疗急性肺损伤的策略：揭示了钩虫压制宿主的主要生物学过程及免疫逃逸机制。这些研究结果为我们进一步认识疾病的发生并发展新的治疗策略提供了新的思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

前言

第一章小鼠肺部钩虫感染表达谱差异基因的筛选

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

第二章 种系效应差异基因的生物信息学分析

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

第三章 时间效应差异基因的生物信息学分析

3.1材料及方法：

3.2结果

3.3讨论

第四章交互效应差异基因的生物信息学分析

4.1材料和方法

4.2结果

4.3讨论

结论

展望

参考文献

技术与方法 GEO(Gene Expression Omnibus)：高通量基因表达数据库

攻读学位期间成果

致谢