应用组织芯片技术研究Skp2、p27在肾细胞癌中的表达及意义

摘要

肾癌(又称肾细胞癌，renalcellcarcinoma，简称RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在泌尿外科肿瘤中占第二位，占。肾脏恶性肿瘤的90％以上，占成人恶性肿瘤的2％-3％。全世界肾癌的发病率每年增加2％，每年死于肾癌者近100000例。由于绝大多数肾癌为先天多药耐药，对传统的放、化疗均不敏感，因此对于早期、局限性肾癌手术治疗仍是主要的治疗手段，其5年生存率可以达到60％-65％。而对于晚期或伴有转移的进展期肾癌，免疫治疗是目前手术治疗外的首选方法，主要应用白介素2(IL-2)和干扰素a(IFN-a)，但是其疗效十分有限，总缓解率仅为10％-20％，药物的毒副作用十分明显。近年来，为了提高肾癌治疗的效果，对基因疗法的应用研究逐渐成为肾癌特别是中晚期肾癌新疗法的研究热点。现普遍认为几乎所有癌基因和抑癌基因的功能效应都与细胞周期机制密切相关。细胞周期紊乱是基因组不稳定的一个中心环节，可使不稳定细胞进一步癌变的机率增高，从而参与肿瘤的发生、发展。因此，研究细胞周期机制相关的癌基因或抑癌基因，并以此为靶点进行诊断、治疗是目前肾癌研究的一大方向。 P27kipl是一种新发现的周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclindependentkinaseinhibitor，CKI)，通过抑制多种G1期周期蛋白依赖性激酶(cyclindependentkinase，CDK)的活性，使细胞不能通过G1期，从而防止细胞过度增殖形成肿瘤。研究表明，P27kipl表达降低与肿瘤不良预后有密切关联，被认为是一种肿瘤的抑制基因。 Skp2(S期激酶相关蛋白2，S-phasekinase-associatedprotein2，简称Skp2)是新近发现的一种癌基因，作为泛素连接酶复合体(skp1-Cullin-F-box，SCF)的底物识别序列，能通过特异性识别磷酸化的底物介导CKI泛素化降解，对细胞周期起调控作用，与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关，在肿瘤中的作用日益受到关注。 最近大量研究发现，在一些恶性实体肿瘤中，P27kipl常呈低表达，而Skp2则高表达，且P27kipl的表达与Skp2呈负相。因此推测，P27kipl的表达下调可能与Skp2的表达增加有关，并且这种关系可能影响肾细胞癌的发生和发展。 组织芯片(Tissuechip或Tissuemicroarray，TMA)技术，是近几年发展起来的以形态学为基础的分子生物学新技术，可在一张切片上规则排列几百个来自不同病例的组织，同时高通量获取组织学、基因和蛋白表达信息的新方法，适用于免疫组织化学和DNA、RNA原位杂交。由于其具有组织用量少，而获取信息量大、试验条件均一，可比性强、减少试剂消耗等优点，在病理学和相关科学的研究中到了广泛的应用。 本研究的目的是利用组织芯片结合免疫组化方法研究Skp2和p27kipl在80例肾细胞癌组织和40例癌旁正常肾组织中的表达与肾细胞癌生物学特征的关系，并研究了两种蛋白之间的相关性。研究内容共分两部分：第一部分组织芯片的研制；第二部分应用组织芯片技术研究Skp2、p27kipl在肾细胞癌中的表达及意义。 第一部分组织芯片的研制 1.1研究方法 供体蜡块包括80例肾细胞癌和40例癌旁正常肾组织。将这些蜡块均作5μm切片，常规HE染色，镜下确定典型的肿瘤及正常组织，并在蜡块上的相应部位作好标记；每例取2个点，使用组织微阵列仪在受体蜡块上制成120(12×10)点阵的组织芯片蜡块；将此蜡块作4μm切片，并作HE染色，镜下观察结果：用HE染色法对组织芯片和芯片上相应病例的常规切片进行染色，将两组观察结果进行比较，计算其符合率，并采用Fisher精确概率检验(Fisher'sExactTest)，进行统计学分析。 1.2研究结果 1.用此方法制作出的组织芯片蜡块四周无开裂现象，组织芯排列整齐，无缺损。HE染色结果见组织芯均匀排布于载玻片上，没有脱片，也无明显移位及扭曲，完全符合观察的需要。 2.组织芯片与常规组织切片HE染色结果比较：组织芯片HE染色结果与普通切片HE染色结果的比较中，组织芯随机取一个点的符合率为95％(114/120；P=0.029)，取两个点的符合率为98.3％(118/120；P=0.498)。这种取点方法之间以及与常规组织切片结果相比无显著性差异(P=0.281)。 1.3研究结论 1.我们制作组织芯片的方法是成功的，完全可以用于肿瘤研究及临床病理诊断。 2.组织芯片与常规组织切片HE染色结果的相比无显著性差异，在大多数情况下从组织芯片中得到的研究结果能够代表相应病例。 第二部分应用组织芯片技术研究Skp2、p27kipl在肾细胞癌中的表达及意义 1.1研究方法 采用组织芯片技术及免疫组化SP法检测Skp2和p27kipl在80例肾细胞癌组织和40例癌旁正常肾组织中的表达。对Skp2及p27kipl与肾细胞癌生物学特征的关系采用x2检验进行统计分析。对Skp2与p27kipl表达的相关性采用Spearman等级相关分析进行统计分析。 1.2研究结果 1.Skp2在肾细胞癌中的表达率高于正常肾组织(P=0.025)；随肿瘤分化程度降低、恶性程度增加，Skp2阳性表达率升高(P=0.002)；其表达率与肾癌患者的年龄、性别、临床分期及肿瘤大小无关(P>0.05)。 2.p27kipl在肾细胞癌中的表达率低于正常肾组织(P=0.007)；p27kipl阳性表达率与肿瘤分级(P=0.030)及临床分期(P=0.003)呈负相关，与肾癌患者的年龄、性别及肿瘤大小无关(P>0.05)。 3.Skp2与p27kiPl表达呈显著负相关(r=-0.273，P=0.014)。 1.3研究结论 1.Skp2在肾细胞癌中的表达率高于正常肾组织；p27kipl在肾细胞癌中的表达率低于正常肾组织。提示Skp2和p27kipl可能为肾细胞癌相关基因。 2.Skp2阳性表达率与肾细胞癌分化程度呈正相关。p27kipl的表达与肿瘤分化程度及临床分期呈负相关。同时证实，Skp2与p27kipl表达强度呈负相关。这提示Skp2可能参与p27kipl表达的调节，并在肾细胞癌的恶性进展中起重要作用。 3.组织芯片技术在肾肿瘤研究过程中体现了样本量大、效率高、误差小、节约成本的特点。为肾癌相关基因的研究提供了一种全新的方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分组织芯片的研制

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分应用组织芯片技术研究Skp2、p27kip1在肾细胞癌中的表达及意义

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

全文总结

参考文献

附录 英文缩写注解

攻读学位期间成果

致谢