Moesin蛋白磷酸化在晚期糖基化终产物介导内皮细胞反应中的作用及机制

摘要

目的:本研究试图证明AGEs通过Moesin蛋白苏氨酸磷酸化使其活化,进而引发F-actin构像的改变和内皮细胞屏障功能的障碍,为进一步阐明糖尿病血管并发症的发生机制提供实验依据,并为其防治提供新的思路和有效的手段。
　　 方法:
　　 本课题以人皮肤微静脉内皮细胞株HMVEC及游离的SD大鼠皮肤微血管为研究对象,在细胞和组织两个层面,应用细胞培养、免疫印记、siRNA干扰、RT-PCR、细胞免疫组化、单层内皮细胞通透性的测定、游离微静脉血管通透性的测定等方法,通过观察AGEs刺激下Moesin蛋白表达和磷酸化水平和定位的变化,及其对内皮细胞骨架形态、屏障功能和血管通透性的影响,阐明Moesin在AGEs介导的内皮细胞形态和功能变化中的作用。AGE修饰的人血清白蛋白(AGE-modified human serum albuminAGE-HSA),由人血清白蛋白与葡萄糖共孵育8周制得。
　　 在细胞水平的研究中,人皮肤微血管内皮细胞分别接种于100mm培养皿,微孔小皿(petridish)和铺有1％明胶的双层通透的培养皿(transwell)顶层小室微孔膜上(直径6.5mm,孔径大小0.4μm),待细胞长至融合后,换无血清培养基2h使细胞获得同步生长。用不同浓度的AGE-HSA与细胞在体外共同培养不同时间,并设立HSA阴性对照组进行比较。在各实验处理组中,分别用可溶性RAGE的抗体(anti-RAGEIgG)、Rho激酶抑制剂(Y-27632)、p38抑制剂SB203580、ERK通路抑制剂PD98059及JNK通路抑制剂SP600125,预处理内皮细胞；或用重组腺病毒MKK6b,p38α,p38β的无活性型突变体预转染内皮细胞,均继以AGE-HSA培养1h。采用westernblot技术检测Moesin蛋白表达和磷酸化Moesin水平的变化,荧光染色法观察细胞骨架蛋白的形态学改变,TRITC荧光标记白蛋白漏出法测定单层内皮细胞的通透系数Pα值,siRNA技术下调Moesin的表达。
　　 结果:
　　 1.AGE-HSA可以时间剂量依赖方式引起游离微静脉通透性的增高插管并测量基础通透系数后,分别用不同浓度(12.5、25、50、100μg/ml)的AGE-HSA或100μg/ml的HSA灌流游离微静脉120min,并每隔15～30min记录一次通透系数。所得Pα值均与自身基础Pα值相比较,并乘以100％。基础Pα设为100,即为每组的自身对照。结果显示AGE-HSA作用于游离微静脉可使其通透性随时间延长而增高。100μg/ml的AGE-HSA使微静脉通透性在30min时就与对照存在显著性差异(P<0.05),并持续升高至120min。从45min起,50μg/ml的AGE-HSA也使微静脉通透系数与对照有显著性差异(P<0.05),并持续升高至120min。12.5和25μg/ml的AGE-HSA组的各时间点的通透系数与其自身对照相比均未产生明显差异(P>0.05)。未经修饰的HSA对微静脉通透性无影响,各组与对照及组间的作用差异均无统计学意义(P>0.05)。
　　 2.siRNA技术证明Moesin参与了AGEs介导的HMVEC形态和功能变化:
　　 (1)siRNA干扰技术抑制了Moesin及ERM蛋白在HMVEC的表达:转染MoesinsiRNA48h可显著下调MoesinmRNA的表达水平,并使Moesin蛋白和ERM蛋白的表达与对照相比分别降为34±8％和38±9％。转染controlsiRNA则无此作用。证明本实验所用的siRNA实验体系可以有效的下调Moesin的表达,并且证明在内皮细胞中主要表达的ERM蛋白为Moesin。
　　 (2)干扰Moesin表达后可抑制AGE-HSA刺激引起的细胞功能和形态变化:转染controlsiRNA和MoesinsiRNA的内皮细胞,均显示F-actin主要分布在细胞周边,线条完整连续,显示出内皮细胞的典型的鹅卵石样轮廓。细胞间连接紧密,未见明显缝隙形成。预转染controlsiRNA的内皮细胞,再继以50μg/mlAGE-HSA作用1h,F-actin外周致密带边缘变得毛糙不规整,出现锯齿样断裂,趋于变细崩解消散,F-actin在胞浆内弥散分布,形成由非极性单行排列的肌动蛋白丝组成的应力纤维。
　　 3.AGE-HSA时间和剂量依赖性地介导Moesin的磷酸化:
　　 (1)用westernblot的方法检测AGE-HSA刺激后HMVEC胞浆内Moesin蛋白表达和磷酸化Moesin(T558)水平的变化,发现50μg/mlAGE-HSA刺激后不同时间(5、10、20、30、45、60、120min)Moesin蛋白表达无明显改变,而磷酸化Moesin于刺激后45min开始增加,60～120min达高峰。
　　 (2)AGE-HSA可以时间剂量依赖的方式引起ERM蛋白的磷酸化,而对ERM蛋白的表达没有影响。
　　 (3)siRNA干扰Moesin表达后,AGE-HSA刺激没有使Moesin磷酸化增多:预先转染MoesinsiRNA可显著降低AGEs所诱导的Moesin磷酸化水平的升高,而预转染controlsiRNA则无此作用。
　　 4.AGE-HSA通过与RAGE结合介导Moesin磷酸化及内皮细胞功能障碍:
　　 (1)预孵育100μg/mlRAGE抗体1h,再给予50μg/mlAGE-HSA作用1h,结果显示RAGE抗体可有效减少AGE-HSA所致Moesin磷酸化。
　　 (2)在组织水平,插管并记录基础通透系数后,用RAGEAb(50,100μg/ml)预灌流微静脉1h,记录其通透系数,冲洗并更换为含50μg/ml的AGE-HSA的灌流液继续灌流1h,再次记录通透系数。所得Pα值分别与其自身的基础Pα值比较,得到相对Pα值。
　　 5.AGE-HSA可诱导ROCK和p38的磷酸化AGE-HSA可使磷酸化的ROCK和p38MAPK表达显著增高,HSA则无此作用。且用MoesinsiRNA使Moesin表达减少,并不能抑制AGE-HSA诱导的ROCK磷酸化的增多,提示ROCK和p38MAPK通路参与了AGEs对内皮细胞功能的影响,且ROCK是在Moesin的上游发挥作用。
　　 6.ROCK参与了AGE-HSA引起的Moesin磷酸化及内皮细胞功能障碍(1)预先加入ROCK抑制剂Y-27632(25μmol/L)30min,再给予50μg/mlAGE-HSA作用1h,可有效减少AGE-HSA所致Moesin蛋白磷酸化。
　　 (2)在组织水平,插管并记录基础通透系数后,用Y-27632(10,25μmol/L)预灌流微静脉30min,继以含50μg/ml的AGE-HSA的灌流液继续灌流1h,可使Pα值分别降至188.2±26.2％和165.7±30.2％,显示出剂量依赖效应(P<0.05)。抑制剂本身对血管通透性无影响。证明ROCK参与介导了AGE-HSA引起的Moesin磷酸化和对内皮细胞功能的影响。
　　 7.p38通路参与了AGE-HSA引起的Moesin磷酸化及内皮细胞功能障碍:
　　 (1)预先加入p38MAPK抑制剂SB203580(25μmol/L)30min,再给予50μg/mlAGE-HSA作用1h,可有效减少AGE-HSA所致Moesin蛋白磷酸化。p38上游激酶MKK6b结构活性型突变体的重组腺病毒MKK6b(E),在无外来刺激的情况下即可使Moesin磷酸化水平显著增多；且MKK6b的无活性突变体MKK6b(A)可明显抑制AGE-HSA对Moesin磷酸化的作用；p38α亚型的无活性突变体p38α(A)也可显著抑制AGE-HSA对Moesin磷酸化的作用,p38β(A)则无此作用；且p38α(A)与MKK6b(E)共转染,可阻断后者对Moesin磷酸化的作用,而p38β(A)则不可阻断MKK6b(E)的作用。
　　 (2)在组织水平,预先给予SB203580(10,25μmol/L)可使相对Pα值分别降为195.7±42.4％和163.5±30.7％(P<0.05)并显示出剂量依赖效应。
　　 8.AGE-HSA作用后引起磷酸化Moesin在细胞内分布的改变在激光共聚焦显微镜下观察,可见在正常内皮细胞中,非磷酸化Moesin主要分布在胞浆区域。
　　 结论:
　　 1.AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引血管通透性的增高。
　　 2.AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起磷酸化的Moesin、ERM蛋白表达增多。抑制Moesin蛋白的表达,可显著抑制AGEs诱导的内皮细胞功能障碍,提示AGEs通过使Moesin蛋白磷酸化引起细胞骨架改变,进而导致内皮细胞功能障碍。
　　 3.可溶性RAGE的抗体可阻抑AGEs诱导的Moesin磷酸化和血管通透性升高,提示AGE-RAGE的结合在转导信号入细胞的过程中起重要作用。
　　 4.ROCK抑制剂可阻抑AGEs引起的Moesin磷酸化及内皮细胞功能障碍,且阻止Moesin的表达并不能影响AGEs所引起的ROCK磷酸化增多,提示Rho激酶参与了这一病理过程,且位于Moesin蛋白的上游。
　　 5.p38MAPK参与了AGEs介导的Moesin磷酸化及内皮细胞功能障碍的信号转导过程,其中p38MAPK主要通过其α亚型发挥作用。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

1 实验材料与主要试剂

2 主要溶液配制

3 主要实验仪器及设备

4 实验方法

5 实验设计

6 统计学处理

实验结果

第一部分 Moesin蛋白参与AGEs诱导内皮细胞功能障碍中的作用

第二部分 AGE-HSA引起Moesin磷酸化的信号转导通路

讨论

1 方法学的讨论

2 Moesin在AGEs诱导内皮细胞功能障碍中的作用及其机制

结论

参考文献

英文缩略词

成果

致谢

统计学证明