包裹多柔比星PLGA微球骨水泥的研制及其成骨和抗肿瘤作用研究

摘要

目的： 研究包裹空白微球骨水泥的生物相容性和包裹多柔比星微球骨水泥的力学强度、体外降解和释药特点，观察包裹多柔比星微球骨水泥的成骨作用和抗肿瘤性能。为包裹多柔比星微球骨水泥用于肿瘤切除术后骨缺损修复和抗肿瘤的可行性提供实验依据。 方法： 1.包裹PLGA微球骨水泥的生物相容性 （1）骨水泥粉末的制备按化学沉淀法合成磷酸钙晶体（PCCP），将PCCP和无水二磷酸盐（DCPA）按1：1配置而成。 （2）微球的制备采用复乳溶剂挥发法制备微球。 （3）纯骨水泥的制备以15%的柠檬酸钠作为水相，将CPC按体积重量比0.4 ml·g-1加入柠檬酸钠溶液并均匀搅拌。然后在特制模具中制备成柱状骨水泥。 （4）包裹微球骨水泥的制备将微球与CPC粉末以3：7的比例均匀混合，制备成柱状包裹药物微球骨水泥。 （5）实验分组按研究对象不同，将细胞相容性实验分为3组：空白对照组；CPC组，即纯骨水泥组；CPC/M组，即包裹有微球的骨水泥。体内生物相容性研究中又将CPC组和CPC/M组各分为3个浓度或剂量亚组。 （6）材料和浸提液的制备浸提液的制备：材料称重，密封后经60Co灭菌，以每1g样品加入10ml细胞培养液，在37℃，CO2体积分数为5%的无菌条件下浸提72h作为浸提液。 （7）细胞生长曲线将基质干细胞细胞悬液，接种96孔板，每孔200μL，置于37℃±2℃，CO2体积分数为5%的培养箱中开放培养24h，使细胞贴壁。弃去培养液，加入等量的浸提液，再放入37℃±2℃，CO2体积分数为5%的培养箱内分别培养2、4、6、8、10天。在各观察期加入CCK-8试剂，在免疫酶标仪上以450nm波长测定吸光度值。 （8）光镜和电镜观察在每次进行细胞增殖实验前，无菌操作下取出培养板，观察浸提液和材料中各孔细胞的生长状态。对材料组和浸提液组的细胞生长状态进行观察、分析。将人骨髓基质干细胞接种于材料上，行扫描电镜观察。 （9）急性毒性实验取昆明种小鼠30只，分为生理盐水组（NS）、CPC组和CPC/M组，分别行尾静脉注射生理盐水和2种浸提液原液，每只注射量1ml。注射后24 h、72h和120h称量小鼠体重并观察反应。 （10）溶血试验将不同浓度的材料生理盐水浸提液（0.1g·ml-1、0.05g·ml-1、0.01 g·ml-1），生理盐水（阴性对照）和双蒸水（阳性对照），每组各5份，每管2ml。再在每管分别加入2%新鲜健康人血悬液2ml。在分光光度计540nm处测定各样本光密度，计算溶血率。 （11）微核试验将80只小鼠随机分成8组：2种材料的低（1ml）、中（2ml）、高（4ml）剂量组，阴性对照组（生理盐水）和阳性对照组（环磷酰胺40mg/kg）。用30h给受试物法。取股骨常规涂片，涂片自然干燥后固定，Giemsa染色10～15min。在油镜下观察。每只动物计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，每组以微核总数占5000个细胞中的比例计算。 （12）热原试验健康新西兰白兔6只，间隔1h测量肛温3次，取平均值，确定为正常体温。自耳缘静脉缓慢注入无菌水泥浸提液，5 ml/只，注射后1，2，3h测定家兔体温3次，与正常体温相比，确定其升高度数。 2.包裹多柔比星PLGA微球骨水泥的制备和表征 （1）实验分组按研究对象不同，将实验分为3组：A组（CPC组），即材料中只有骨水泥，不含药物和药物微球；B组（CPC/D组），即含有多柔比星（DOX）药物的骨水泥；C组（CPC/M/D组），即包裹有DOX药物PLGA微球的骨水泥。 （2）电子显微镜观察将微球、纯骨水泥、载药骨水泥、载微球骨水泥材料样本行真空镀膜仪喷金，用扫描电镜在不同放大倍数下观察样本结构特征，测量微球的粒径。 （3）X线衍射法将骨水泥粉末与柠檬酸溶液按固液比为1：0.4（g：ml）混合后置于37℃，100%湿度下4周，然后用丙酮浸泡1h，真空干燥，采用X线衍射（XRD）分析仪测试样品的化学成分。 （4）骨水泥的抗稀散性按体积重量比0.4 ml·g-1在骨水泥粉末中加入柠檬酸钠溶液并均匀搅拌，充分混合1min后制成球状，迅速投入到生理盐水（37℃）中静置24h，通过肉眼观察表面稀散情况进行评价。 （5）凝结时间分别对3组骨水泥的在25℃和37℃下凝结时间进行测定。用特定装置对初凝时间和终凝时间分别进行测量。每个凝结时间测量6个标本，取平均值。 （6）可注射性用带有1.6mm内径针头的，针筒内径为14.5mm的注射器来测量3组骨水泥的可注射性能。在将骨水泥粉末与柠檬酸钠混匀搅拌1min后，立即将其倒入针筒中。在注射器内芯的上方垂直加5kg的压力2min。每组重复6次，记录注射前后的骨水泥的针筒中的骨水泥的质量并计算可注射性。 （7）孔隙率的测定根据Archimedean原理，根据排水（乙醇）法来粗略测量样品的孔隙率。 （8）抗压强度将试件置于万能生物力学试验机上进行最大抗压强度的测定，施加载荷速度为0.1 mm·min-1，记录标本样条的最大抗压强度和断裂强度。 3.包裹多柔比星PLGA微球骨水泥的体外释药和降解 （1）载药率与包封率的测定准确称取冷冻干燥的微球5mg溶于二甲亚砜中，超声振荡至微球完全溶解，将微球溶液用超速离心机离心2h，取上部溶液，用紫外分光光度计测定试样在480nm处的吸光度。计算出各自DOX的含量。 （2）体外药物释药特性取48个小瓶，每个瓶内放置100mg微球，加入5ml的0.1mol·L-1 PH7.4的SBF液，37℃下浸泡24小时，随机取6个小瓶的微球，按浸泡后第1、3、5、7、10、14、21、28天留取浸出液，检测各时间点浸出液在480nm处的吸光度，计算微球的释药量。 （3）CPC/D和CPC/M/D的体外释药特性从已制备好的2组含有药物成份的骨水泥中各随机抽取2块骨水泥试样，分别置于盛有SBF的烧杯中，测量浸提液在不同时间点的480nm处吸光度。记录每个时间点测得的样本吸光度，并计算出其释药量。 （4）载药微球的体外降解精密称取30等份，质量均为100mg的DOX微球和空白微球，分别加入SBF液浸泡，计录不同时间点上微球的重量，计算微球的重量丢失。 （5）CPC、CPC/D和CPC/M/D的降解每组各取35个已制备好的干燥骨水泥标本，称重后加入100 ml的SBF中浸泡。每次从各组取出6块标本分别称重，计算骨水泥样本重量丢失；另外6块用于测量其屈服应力并进行电镜观察。 4.包裹多柔比星PLGA微球骨水泥的体内成骨作用 （1）实验动物和分组2周龄新西兰大白兔40只，随机配成20对，将每对动物的4个桡骨依次分成4组：空白组、CPC组、CPC/D组、CPC/M/D组。 （2）动物模型的制备实验模型的制备：用3%戊巴比妥钠（1ml/g）耳缘静脉麻醉，然后制备双侧1.5 cm长的骨膜-桡骨缺损。对3个材料组的桡骨行材料植入，对空白组的桡骨只造成缺损模型，但不植入材料。 （3）大体观察术后观察动物饮食，活动情况，以及伤口有无肿胀、分泌物出现。取材后观察成骨及材料降解情况。 （4）X线检查术后2、4、8、16周各取5对动物拍摄正位X射线片，观察各组动物骨缺损区的骨痂生长、材料降解及骨连接情况。 （5）生物力学分别于术后2、4、8、16周随机从3组材料组中取5对兔子处死，切取完整桡骨标本，剔净骨膜及软组织后，测量各组标本弯曲强度，取各组标本的平均值进行统计学分析。 （6）骨水泥成分 X光衍射图谱确定术后第4周时各组骨残余骨水泥的成分。 （7）标本的病理学观察术后16周时分别处死相应组的大白兔，切除双侧桡骨，固定，脱钙，脱水，透明，石腊包埋后切片，烘干后脱蜡，常规HE染色，并在光学显微镜下观察骨水泥在骨内的代谢情况。 5.包裹载多柔比星PLGA微球骨水泥的抗肿瘤作用 6.统计学处理 结论: 制得的包裹PLGA微球骨水泥具有良好的生物相容性，而复合药物PLGA微球的骨水泥同样具有良好的可注射性、力学强度可等一般特性，包裹多柔比星微球骨水泥具有良好的降解和药物缓释作用。当包裹多柔比星微球骨水泥植入体内填充骨缺损时，可以促进新骨形成的作用。包裹多柔比星骨水泥的浸提液在体外和体内都具有抗肿瘤作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词对照表

声明

前言

第一部分包裹PLGA微球骨水泥的生物相容性

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4参考文献

第二部分包裹多柔比星PLGA微球骨水泥的制备和表征

引言

1材料和方法

2结果

3讨论

4参考文献

第三部分 包裹多柔比星PLGA微球骨水泥的体外释药和降解

引言

1材料与方法

2结果

3讨论

4参考文献

第四部分 包裹多柔比星PLGA微球骨水泥的体内成骨作用

引言

1材料与方法

2结果

3讨论

4参考文献

第五部分 包裹多柔比星PLGA微球骨水泥的抗肿瘤作用

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4参考文献

结论

综述　磷酸钙骨水泥研究最新进展

攻读学位期间成果

致谢

统计学证明